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目的镉是常见的环境和工业污染物,国际癌症研究机构将镉列为Ⅰ类致癌物。环境中的微量镉进入机体可通过生物放大和积累而产生严重的损害效应。人们除通过职业暴露于高水平的镉外,还通过吸烟、膳食等暴露于低水平镉。镉暴露可能导致骨质疏松,但其损害机制仍不清楚。因此,深入研究镉致骨骼损伤的机制可为有效预防镉对机体的健康危害和治疗镉所致骨质疏松提供科学依据。本课题组前期对某高镉地区骨质疏松患者调查发现其活性糖皮质激素升高,文献提示糖皮质激素能激活骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的自噬,影响其成骨分化,而局部糖皮质激素由11β-羟基类固醇脱氢酶 1(11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1,11β-HSD1)活化才能起作用。因此本研究提出假设,镉可能通过上调糖皮质激素代谢酶11β-HSD1,激活BMSCs自噬影响细胞成骨分化,该效应也可能通过自噬经典通路mTOR信号通路起作用,引起骨形成减少,最终导致骨质疏松。方法用碱性磷酸酶染色试剂盒检测人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化后碱性磷酸酶形成情况;用茜素红染色试剂盒检测矿化结节形成情况;用碱性磷酸酶活力测试试剂盒检测碱性磷酸酶活力;用Cell Counting Kit-8检测不同浓度氯化镉(cadmium chloride,CdCl2)对hBMSCs的细胞毒性并确定处理浓度;用qRT-PCR 检测 ALP、Runx2、Osterix 和 11β-HSD1 的 mRNA 水平;用 Western Blot检测 ALP、Runx2、Osterix、11β-HSD1、mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、Beclin-1和LC3B蛋白水平。结果hBMSCs成骨诱导分化21d,ALP和矿化结节形成增加,hBMSCs被诱导为成骨细胞。CdCl2对hBMSCs的细胞毒性呈剂量-效应关系,低浓度(≤3.5μM)不影响细胞活力,超过5.0 μM时抑制细胞活力。2.5μM和5.0μM CdCl2处理成骨诱导分化中的hBMSCs1 d、4d、7d和14 d,与对照组相比,随着CdCl2浓度增加,ALP和矿化结节形成减少,成骨标志物ALP、Runx2、Osterix的mRNA和蛋白水平均下降,CdCl2抑制hBMSCs向成骨细胞分化。CdCl2处理成骨诱导的hBMSCs7 d,与对照组相比,镉处理组自噬相关蛋白(Beclin-1和LC3B)表达增多,11β-HSD1的mRNA和蛋白水平升高,mTOR信号通路相关蛋白(mTOR、p-mTOR、p-P70S6K)表达均降低,表明CdCl2上调了 11β-HSD1表达,抑制了 mTOR通路,从而激活hBMSCs成骨分化中的自噬。11β-HSD1抑制剂BVT 2733与CdCl2联合处理细胞,与CdCl2组比较,成骨标志物形成增加,自噬减弱,但对mTOR信号通路无明显影响;mTOR激活剂MHY 1485与CdCl2联合处理细胞,与CdCl2组比较,自噬减弱,但11β-HSD1无明显变化,表明11β-HSD1和mTOR平行地对CdCl2影响hBMSCs成骨分化中的自噬起作用。结论1.CdCl2抑制ALP、矿化结节形成和成骨标志物ALP、Runx2、Osterix表达,提示CdCl2抑制hBMSCs成骨分化。2.CdCl2抑制hBMSCs成骨分化过程中,上调11β-HSD1、抑制mTOR信号通路、激活自噬,提示CdCl2可能作用于11β-HSD1和mTOR信号通路,激活自噬,从而抑制成骨分化。3.低表达11β-HSD1对mTOR信号通路无明显影响;激活mTOR信号通路对11β-HSD1无明显影响,提示CdCl2可以通过11β-HSD1激活hBMSCs分化中的自噬,或者通过mTOR信号通路激活自噬,从而抑制成骨分化。