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随着世界人口老龄化现象的日益突出,神经退行性疾病逐渐成为第二大危害人类健康的疾病。其中帕金森病（Pαrkinson’s diseαse,PD）的发病率位居全球第二。目前认为PD是由于黑质致密部多巴胺（Dopαmine,DA）能神经元退行性病变、纹状体内DA绝对含量减少而引起的,同时伴有神经元内路易小体（Lewy body,LB）的沉积以及路易神经突（Lewy neuritis,LN）的形成。具体病因与环境、年龄、遗传、氧化应激以及蛋白质清除功能障碍等因素相关。左旋多巴替代治疗是目前最有效的PD药物治疗方法,但该方法并不能延缓PD的病理进程,且长期使用可以诱导黑质细胞的凋亡,加重疾病进程。因此,探索发现新的PD神经保护策略显得尤为重要。流行病学统计显示,吸烟能够降低PD和老年痴呆症（Alzheimer’s diseαse,AD）发病率。研究发现,烟草制品中的关键成分烟碱（尼古丁）主要激活配体门控离子通道蛋白-烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic αcetylcholine receptors,nAChRs）发挥作用,延缓了 PD的病理进程,但是烟碱作为非特异性nAChRs激动剂可激活其他受体对迷走神经产生损伤作用,因此应选择nAChRs中高度特异性受体来研究其对PD的保护作用机制。而在脑内多种nAChRs亚型中,α7-nAChRs亚型表达尤为丰富也是较为特殊的一种亚型。α7-nAChRs具有很高的钙渗透性,能够调节众多钙依赖的细胞信号转导通路,影响众多中枢神经系统功能,包括发育、存活、突触可塑性、神经递质释放和免疫应答等,从而调节着高级行为如运动、焦虑、学习、记忆和感觉门控等。我们的前期研究已经发现:激活α7-nAChRs对PD动物模型具有保护作用,但具体机制尚不清楚。神经元和星形胶质细胞上均表达α7-nAChRs,本研究工作拟探讨激活α7-nAChRs 对 1-甲基4-苯基吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）诱导的神经细胞凋亡的保护作用及机制,为探索α7-nAChRs的神经保护机制提供可靠思路和实验基础。本文工作第一部分以SH-SY5Y人成神经母细胞瘤细胞系为研究对象,通过MPP+建立PD细胞模型,研究激活α7-nAChRs对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及其机制;第二部分以小鼠原代星形胶质细胞为研究对象,通过MPP+建立PD细胞模型,研究激活α7-nAChRs对MPP+诱导的星型胶质细胞凋亡的保护作用及其机制。本研究不仅拓展α7-nAChRs的药理学机制,更为研究有效治疗PD的药物提供了新思路。第一部分 激活α7-nAChRs抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡目的:研究激活α7-nAChRs对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用,阐明激活α7-nAChRs对神经元凋亡的保护作用机制。方法:制备MPP+细胞毒性模型,给予不同剂量α7-nAChRs非选择性激动剂烟碱（nicotine,NIC）和α7-nAChRs选择性激动剂PNU-282987,通过四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的技术检测药物对细胞活力的影响;应用Hoechst33342荧光染色和流式细胞技术观察药物对细胞凋亡的作用;通过免疫印迹法（western blotting,WB）技术观察药物对凋亡相关蛋白、MAPK、p53及NF-κB的影响。预先给予α7-nAChRs拮抗剂甲基牛扁碱（methyllycaconitine,MLA）,研究拮抗α7-nAChRs对NIC和PNU-282987凋亡保护作用的影响。应用siRNA沉默α7-nAchRs的表达,研究α7-nAchRs表达变化对NIC和PNU-282987凋亡保护作用的影响。结果:（1）10 μM NIC和10 μM PNU-282987能显著抑制MPP+引起的SH-SY5Y细胞活力的降低,减少LDH的释放;该作用能被100 nM MLA所阻断;（2）Hoechst33342荧光染色发现,NIC和PNU-282987能减少MPP+诱导的SH-SY5Y细胞核染色质浓缩,降低凋亡细胞数;该作用能被拮抗剂MLA所取消;（3）流式细胞技术表明,NIC和PNU-282987减少Annexin V/PI标记的阳性细胞数;该作用能被拮抗剂MLA所阻断;（4）对凋亡相关蛋白的研究表明,NIC和PNU-282987能降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2的蛋白水平,该变化能被拮抗剂MLA取消;（5）对MAPK信号通路的研究表明,MPP+增加JNK和p38 MAPK磷酸化水平,降低ERK的磷酸化水平;预给NIC和PNU-282987后能够取消上述蛋白磷酸化水平改变;拮抗剂MLA可明显阻断PNU-282987引起的JNK,p38 MAPK以及ERK的磷酸化水平改变,但对NIC引起的JNK和p38 MAPK的磷酸化水平变化无明显影响,却仅可阻断NIC引起的ERK磷酸化水平的变化;（6）对NF-κB和p53信号通路研究表明,MPP+增加p53磷酸化水平和p65表达;PNU-282987可降低p53磷酸化水平和p65表达,但NIC只能降低p53磷酸化水平;拮抗剂MLA可明显阻断PNU-282987对p53磷酸化水平和p65表达变化的影响,但对NIC组中p65表达的变化无明显影响,却仅作用于p53磷酸化水平改变;（7）si-CHRNA7沉默α7-nAChRs的表达,不影响MPP+对细胞活力和LDH释放的影响,但可取消NIC和PNU-282987的保护作用;α7-nAChRs表达下调可取消NIC和PNU-282987对Bax、Bcl-2蛋白的调节作用,同时也取消NIC和PNU-282987对凋亡细胞的抑制作用。结论:激活α7-nAChRs不直接影响MPP+对神经元的毒性作用,而是通过调节p53信号通路和MAPK信号通路减轻MPP+所致SH-SY5Y细胞的凋亡。第二部分 激活α7-nAChRs抑制MPP+诱导的星形胶质细胞凋亡目的:研究激活α7-nAChRs对MPP+诱导的星形胶质细胞凋亡的保护作用,阐明激活α7-nAChRs对星形胶质细胞凋亡的保护作用机制。方法:培养小鼠原代星形胶质细胞,应用免疫荧光染色计数星形胶质细胞纯度;制备MPP+细胞毒性模型,给予不同剂量PNU-282987及其拮抗剂MLA,应用MTT和LDH方法观察α7-nAChRs对MPP+所诱导的细胞损伤的影响;应用Hoechst33342荧光染色、TUNEL以及流式细胞术检测α7-nAChRs对细胞凋亡的影响;应用WB技术检测α7-nAChRs对凋亡相关蛋白、MAPK、p53及NF-κB信号通路的影响。结果:（1）100 pM PNU-282987能显著抑制800 μM MPP+引起的星型胶质细胞活力的降低,减少LDH的释放,该作用能被MLA所逆转;（2）Hoechst33342荧光染色发现,PNU-282987能显著减少MPP+诱导的的星形胶质细胞核染色质浓缩,降低凋亡细胞数;该作用能被拮抗剂MLA所阻断;（3）流式细胞技术表明,PNU-282987能显著减少星形胶质细胞中Annexin V/PI标记的阳性细胞数;MLA可以逆转该效应;（4）TUNEL染色发现,PNU-282987能显著减少星形胶质细胞中凋亡细胞数;该作用能被拮抗剂MLA所阻断;（5）对凋亡相关蛋白的研究表明,PNU-282987可降低星形胶质细胞中Bax蛋白的表达,增加Bcl-2的蛋白水平,降低cleaved-caspase3/caspase3的表达,该作用能被拮抗剂MLA所阻断;（6）对MAPK信号通路的研究表明,MPP+增加JNK和p38 MAPK磷酸化水平,降低ERK的磷酸化水平;PNU-282987取消上述蛋白磷酸化水平改变;拮抗剂MLA可明显阻断PNU-282987引起的JNK,p38 MAPK以及ERK MAPK的磷酸化水平改变;（7）对NF-κB信号通路研究表明,MPP+增加星形胶质细胞中p53磷酸化水平和p65表达;PNU-282987可降低p53磷酸化水平和p65表达;拮抗剂MLA可明显阻断p53磷酸化水平和NF-κB p65表达的变化。结论:激活α7-nAChRs后可通过调节p53、NF-κB信号通路以及MAPK信号通路减轻MPP+所致星型胶质细胞的凋亡。综上所述,本文工作主要创新之处:1.发现激活α 7-nAChRs对MPP+诱导的神经元和星形胶质细胞的凋亡均具有保护作用,为以后深入研究α7-nAChRs对神经元-星形胶质细胞网络的作用提供了实验基础。2.阐明激活α7-nAChRs不直接影响MPP+对神经元细胞的毒性作用,而是通过调节p53、NF-κB以及MAPK信号通路,为进一步探讨α7-nAChRs的神经保护机制提供了依据。