DNA磷硫酰化修饰是在DNA上的一种独特的表观遗传学修饰,其中,非桥接的氧原子以序列选择性和立体定向方式被硫取代。这是首次在DNA磷酸核糖骨架上发现的生理修饰,也是首次在DNA中发现除碳、氢、氧、氮、磷外的第六种元素-硫元素。磷硫酰化修饰最初是从变铅青链霉菌提取DNA在电泳过程中发生降解而发现的,至今已在200多种细菌和古细菌中被检测到,但修饰频率不一样,且存在修饰序列多样性。最近,单分子实时测序以及碘断裂高通量测序揭示了磷硫酰化修饰平均分布在整个大肠杆菌基因组上,并且只存在于部分GAAC/GTTC序列上,具有部分修饰的特征,推测修饰频率的调控对其功能具有重要功能。前期的研究也发现沙门氏菌中dpt B基因在转录水平上负调控磷硫酰化修饰基因簇dpt BCDE的表达来控制磷硫酰化修饰水平,但Dpt B蛋白与DNA的保守结合序列5’-ACGTAA-3’只存在于部分菌中,在其它细菌如荧光假单胞菌和变铅青链霉菌中并不存在。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,充分理解磷硫酰化修饰的功能,本论文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。首先,通过构建spfB基因缺失和回补菌株,对比野生型荧光假单胞菌Pf0-1的碘断裂程度,发现spfB基因负调控磷硫酰化修饰表型。再对磷硫酰化修饰基因簇spfBCDE内共转录单元进行分析,发现4个基因在同一转录单元内。荧光定量RT-PCR结果显示,spfB基因突变株中磷硫酰化修饰基因簇spf的转录量相比野生型荧光假单胞菌Pf0-1有较大的升高,spfB基因回补菌株则和野生菌株有相似的转录水平。这些结果表明荧光假单胞菌Pf0-1中spfB基因负调控磷硫酰化修饰基因spfBCDE的表达。其次,为了验证SpfB蛋白是通过结合spfBCDE的启动子区域发挥负调控作用,以及寻找SpfB蛋白可能的DNA结合序列,开展了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB前一段启动子序列的结合活性,从而影响spfBCDE的转录。进一步通过DNase I Footprinting实验,精确定位了SpfB蛋白与DNA结合序列,具有两段结合区域,并且每个区域都存在5’-TGTTTGT-3’的保守结合位点。明显不同于以往研究的沙门氏菌中的DNA结合序列,对目前所有的具有磷硫酰化修饰基因的菌株通过生物信息学分析,发现该结合序列特异存在于荧光假单胞菌Pf0-1中。总之,本研究通过构建荧光假单胞菌spfB基因的敲除突变株及回补株,以及通过碘断裂实验、RT-PCR转录分析,研究了spfB基因对磷硫酰化修饰基因簇spfBCDE的调控作用。通过EMSA和DNase I footprint实验,得到了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spfBCDE的启动子区域5’-TGTTTGT-3’相结合。揭示了SpfB是作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spfBCDE的表达。这些工作对于磷硫酰化修饰的调控机制有了进一步了解,也为全面理解磷硫酰化修饰的功能奠定了基础。