肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)简称肾癌,是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,由于肾癌的发病机制尚不够明晰,且放化疗效果不佳,因而导致患者预后不良。近年来相关免疫治疗及靶向治疗的手段也只对少数肾癌晚期患者有效,总体治疗效果不理想。因此深入探究肾癌发病机制,挖掘新的有效治疗靶点的研究无疑对肾癌的控制和治愈具有重要意义。F114a2基因是一个目前功能未有确切报道的基因。本小组之前的研究中发现,F114a2基因在肾癌患者中具有一定突变率,基因高表达对肾癌患者的预后具有积极影响,该基因可抑制肾癌细胞的增殖及侵袭转移。为证实前期的初步发现,本研究用不同材料、不同分析方法进一步探究了F114a2基因影响细胞周期的功能,重点在细胞水平上分析了F114a2及阿糖胞苷(Ara-C)对肾癌细胞增殖的影响,并结合裸鼠成瘤实验对阿糖胞苷调控肾癌细胞周期的机制进行了初步探索。本论文取得的结果主要有:1.F114a2对肾癌细胞周期的影响通过对肾癌患者组织样本中的癌变组织及其对应癌旁组织的组织芯片进行免疫组化实验,检测F114a2的表达差异,结果显示F114a2在肾癌组织中显著低表达。运用Ualcan、GEPIA数据库进一步分析F114a2对患者预后的影响,发现F114a2高表达患者具有更高的生存率。将HEK-293T、OSRC2、786-O细胞作为后续研究对象,利用慢病毒包装技术分别在三个细胞系中上调或下调表达F114a2,运用EDU染色技术,分析改变F114a2表达水平后对HEK-293T细胞的影响,结果表明上调F114a2表达水平能显著抑制细胞增殖。运用PI染色的方法,通过流式细胞仪检测786-O和OSRC2细胞系中细胞周期分期的情况发现,上调表达F114a2后,两种细胞的细胞增殖周期均在一定程度上被阻滞在G1期。2.F114a2靶向药物阿糖胞苷对肾癌细胞周期的调控作用阿糖胞苷是主要作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢药物,可抑制细胞周期的正常转换从而抑制增殖。在OSRC2细胞中,通过阿糖胞苷药物处理并检测F114a2表达量变化,结果表明阿糖胞苷可以在肾癌细胞中诱导F114a2基因的表达。因此将OSRC2细胞作为后续研究的主要对象,利用细胞计数、细胞活力检测、流式细胞周期分析及细胞克隆的方法检测了阿糖胞苷对细胞增殖的影响,实验结果显示阿糖胞苷能够在体外抑制肾癌细胞的增殖。在皮下移植瘤实验中,也得到了一致的研究结果。在皮下瘤组织中调查INK4家族基因及CDK4、CyclinD1的表达水平发现,经过阿糖胞苷治疗,INK4家族四个基因CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN2D表达升高,CDK4、CyclinD1表达降低。通过对肾癌患者的癌组织与相应的癌旁组织进行实时定量PCR及免疫组化,结果显示INK4家族基因和CDK4存在表达差异,CyclinD1的表达则没有差异。进一步在OSRC2中分别上调表达INK4家族基因、CDK4和CyclinD1,发现改变INK4家族基因和CDK4的表达能影响细胞周期进而影响细胞增殖。我们通过CO-IP、WB和免疫荧光等实验探究发现,INK4家族基因是通过影响CyclinD1-CDK4复合体的形成导致细胞周期在G1期阻滞,进而影响细胞周期的进程。皮下瘤实验模型证明INK4家族基因可抑制肾癌的形成和发展。由此证明,阿糖胞苷通过影响CyclinD1-CDK4复合体的正常形成从而抑制肾癌细胞增殖。此外,在OSRC2细胞中降低INK4家族基因表达水平,发现添加阿糖胞苷后CDK4、CyclinD1的表达均有一定程度的降低,证明阿糖胞苷可直接影响CDK4、CyclinD1的表达。综上,本研究对F114a2基因及其靶向药物阿糖胞苷在肾癌细胞的细胞周期调控中的作用进行了初步探索,证明F114a2可造成肾癌细胞周期G1期阻滞从而影响细胞增殖;阿糖胞苷作为抗代谢药物可在肾癌细胞中诱导F114a2的表达,并且通过抑制CDK4、CyclinD1表达进而抑制肾癌细胞增殖,在肾癌治疗上具有一定的潜在应用价值。