第一部分先天性角化不良基因突变研究先天性角化不良(dyskeratosis congenita, DC)是一种少见的具有临床特征和遗传异质性的遗传综合征。其典型临床表现为皮肤粘膜三联征：甲营养不良、口腔粘膜白斑、网状色素沉着。除上述表现外,本病尚有骨髓衰竭、再生障碍性贫血、肺纤维化、肿瘤易感性等。DC患者一般幼年起病,80%以上DC患者在30岁之前表现为骨髓衰竭,此为DC最主要的死亡原因。Hoyeraal-Hreidarsson(HH)综合征为DKC1突变DC的一种严重表型,临床特点为再生障碍性贫血、免疫功能缺陷、小头颅、小脑发育不全、生长迟缓等。目前已发现DC有三种遗传方式：X-连锁隐性遗传、常染色体显性遗传、常染色隐性遗传；但目前仍约有50%患者遗传特性不明确。其中以第一种遗传方式最为多见,致病基因为DKC1,位于Xq28。 DKC1基因编码角化不良蛋白(dyskerin),此蛋白为核仁蛋白,包含514个氨基酸,是snoRNAs口端粒酶复合体的必要结构成分。DKC1基因包含15个外显子,总长度为15kb。X连锁隐性遗传DC主要是因DKC1(?)义突变所致。以小鼠为研究对象定向裂解DKC1基因可导致小鼠胚胎死亡。11号外显子的p.A353V是一个突变热点,为1058位核苷酸的C>T错义突变,约30%X连锁隐性遗传DC男性患者可检测到p.A353V突变。端粒酶包括端粒酶RNA (TERC)和端粒酶逆转录酶(TERT)。在常染色体显性遗传DC和骨髓衰竭、再生障碍性贫血患者发现TERC和TERT杂合子突变。TERC和TERT均可导致端粒酶功能障碍和端粒缩短。我们收集的一个DC家系的20名家系成员中2人为患者。先证者为16岁男性,自4岁起颈部、前胸、四肢末端出现网状色素沉着。体格检查：典型的舌粘膜白斑,躯干、四肢异常色素沉着,双手足甲板萎缩变薄。血常规、胃镜、胸片、心电图、骨髓涂片及骨髓病理均未见明显异常。根据其皮肤黏膜三联征确诊为DC。此家系中2个患者均为男性,父母无任何临床表现,根据遗传信息考虑X连锁隐性遗传可能性大,故选择DKC1进行基因突变筛查。抽取患者和家系中健康成员、健康对照50例外周血4m1,提取DNA。采用Oligo6.0软件进行引物设计。对DKC1基因15个外显子及侧翼进行PCR扩增及DNA测序。结果表明在DKC1基因第12号外显子中发现一个新的突变位点：c.1192C＞G (p.L398V)。两患者均表现为此位点的突变,母亲为同一位点的杂合突变,家系中正常人和健康对照组未发现此突变。第二部分先天性角化不良患者端粒长度测量在1999年,Mitchell JR发现DC细胞端粒酶RNA水平下降,导致端粒酶活性降低和端粒的缩短。DC发病机制可能为端粒酶功能的缺陷导致端粒长度维持的受损,这样限制了上皮和血液中未分化干细胞的增殖能力。Dyskerin不仅是snoRNAs成分,而且是端粒酶RNA所必需。Dyskerin突变可减少端粒酶RNA蓄积,降低端粒酶RNA活性,导致端粒酶无法维持端粒长度。端粒酶复合体(TERC、TERT, NHP2, NOP10)和shelterin(TINF2)中多个基因的突变均可导致端粒的缩短。近10年的部分研究表明DC的主要致病原因为端粒得不到保护和维持。DKC1和TINF2突变患者较TERC和TERT突变患者发病早且临床表现多样,但这两组之间端粒长度无明显差别。此外,一些遗传特性不明确的DC患者端粒长度也未见缩短。DC与端粒之间的关系仍不明确。基因突变和端粒缩短难以解释DC临床表现异质性。为此,我们研究一X连锁先天性角化不良家系患者端粒长度与临床表型轻重关系。实验对象分三组：DC患者、DC家系正常人以及健康对照组。采用荧光定量PCR方法,对所有研究对象进行端粒长度测量。本研究选取单拷贝基因3684为内参基因,其编码酸性核糖体磷蛋白,位于第12染色体。端粒(T)和单拷贝基因(S)分别进行PCR扩增。对每个研究对象均进行多次T/S测量,T/S平均相对比值即为每个研究对象相对端粒长度。此外我们对患者体格检查、血液系统及肺功能检查等。患者端粒长度与家系中正常人及正常对照组相比均无明显缩短。DC家系中正常人与健康对照组结果进行两样本间的t检验；此两组无统计学差异(t=0.847,P=0.412)。最后结果表明此家系DC患者端粒长度与正常对照组相比无明显差异。