前言:　　 P21活化激酶(P21-activatedkinase,PAK)为一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac、生长因子和细胞外信号的下游主要靶蛋白,参与多种重要细胞活动。PAK家族共有6个家族成员:皆含有氨基末端(N-末端)调节区和羧基末端(C-末端)激酶区。根据它们结构特点及相似性,可分为两大类:Ⅰ类PAK(PAK1-PAK3)和Ⅱ类PAK(PAK4-PAK6)。两类PAK在结构、活化方式、生物学功能上有着很大的区别,它们具有不同的下游靶蛋白。　　 PAK4是目前研究的最为广泛的Ⅱ类PAK,其在许多生物学活动如细胞骨架重排、细胞迁移、细胞凋亡中发挥重要作用。鉴于PAK4在细胞内信号转导通路中的重要作用,本实验室利用酵母双杂交技术从人胎脑eDNA文库中筛选出了若干个PAK4新的相互作用蛋白,并选取了一种较为感兴趣的蛋白P37,验证二者在体内的相互作用。　　 P37蛋白是Mov34家族成员之一,此家族成员都包含一个Mpr1/PadN末端模体(MPN),并与转录、翻译,蛋白酶体的调控有关。目前,P37在翻译起始复合体中的具体作用并未得知,但已知P37对细胞的生长非常重要,缺失此基因的细胞蛋白质合成总量将明显下降。此外,P37具有泛素化酶的活性正向调节Notch信号通路。P37的发现为PAK4肿瘤信号通路的进一步完善提供了新的依据,本课题旨在证实PAK4与P37的相互作用关系,为将来探讨其生物学功能奠定基础。　　 实验材料与方法:　　 一、实验材料　　 (一)基因克隆相关分子生物学试剂　　 (二)酵母双杂交和酵母蛋白、质粒提取相关试剂　　 二、实验方法　　 (一)pGBKT7-PAK4BD和pGBKT7-PAK4KD质粒的酶切及测序鉴定　　 (二)在AH109酵母菌株中验证融合蛋白的表达　　 (三)顺序转染法筛选PAK4相互作用蛋白　　 (四)对阳性克隆进行测序　　 (五)分析阳性克隆的测序结果　　 (六)免疫共沉淀验证PAK4与P37在体内相互作用　　 (七)在BGC-823细胞中免疫沉淀验证内源PAK4与P37的相互作用　　 结果:　　 pGBKT7-PAK4B/K质粒酶切及测序鉴定显示重组质粒构建正确,SDS-PAGE和Westernblotting检测显示,pGBKT7-PAK4B/K融合基因能够在酵母AH109中表达融合蛋白质,利用酵母杂交方法筛选出了多个与PAK4蛋白质相互作用的Ade+/His+/LacZ+阳性转化子,在NCBI上检索得到了P37,P35,P54,P18,P39等蛋白质,它们分别与蛋白质翻译翻译、肿瘤的发生与发展、诱导干扰素产生、蛋白质的泛素化、成骨、调控神经元的发育/维持/存活等相关。我们选取较为感兴趣的P37蛋白,利用免疫共沉淀实验验证了两者在体内的相互作用。　　 结论:　　 筛选出若干与PAK4相互作用的新蛋白,它们分别与蛋白质翻译翻译、肿瘤的发生与发展、诱导干扰素产生、蛋白质的泛素化、成骨、调控神经元的发育/维持/存活等相关。选取感兴趣的蛋白P37通过IP实验证实PAK4与P37在体内能够相互作用。