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胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一种发病隐蔽、进展快、预后差的消化系统恶性肿瘤。在美国，PC的5年生存率小于8%，居癌症死亡率第4位。PC为我国十大常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居癌症死亡率第6位。胰腺导管上皮癌(pancreatic duct adenocarcinoma, PDAC)是PC最常见的组织学类型，约占90%，常发生浸润及转移。PDAC发病机制尚不明确，并且缺乏特异性肿瘤标志物，为诊断和治疗带来了很大的困难。为此，探索PDAC的发生发展机制，寻求肿瘤标志物及靶标，对PDAC的早期诊断、预后判断以及基因靶向治疗具有着重要的作用。
非编码RNA(noncoding RNAs)在人类基因组转录生成物中约占98%，不具有编码蛋白的功能。根据其长度可分为长链非编码RNA(long noncoding RNAs ， lncRNA)及小非编码RNA(small noncoding RNAs,sncRNA )。microRNA(miRNA)是一类长度为18-25nucleotide(nt)的非编码小分子RNA。研究证实，miRNA参与人类生长、发育等过程，并涉及神经系统、心血管系统、炎症、肿瘤等疾病的发生发展。lncRNA长度大于200nt，现已有13000个lncRNA被确认，超过人类基因数量20%(GENCODE version 17)。lncRNA在肿瘤、神经系统等疾病中作为关键的调节因子发挥作用。大量研究发现miRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，其作用机制除了与靶基因mRNA结合外，还可通过与lncRNA的相互作用在肿瘤发生发展中的发挥功能。
miR-23b-3p过去曾命名为miR-23b，本课题组前期发现，miR-23b-3p 在PDAC癌石蜡包埋组织及细胞系中低表达，并且miR-23b-3p低表达组肿瘤体积大、浸润深，以及特异性生存期较短。根据生物信息学预测，发现miR-23b-3p与膜联蛋白A2(annexin A2，ANXA2)存在结合位点。已有研究发现ANXA2在PDAC中呈高表达，可增强PDAC细胞的侵袭以及抗凋亡能力，并可促进PDAC细胞的上皮间质转化(EMT)进程。而miR-23b-3p对PDAC的生物学功能影响、miR-23b-3p与ANXA2在PDAC中的调控关系等均未见相关报道。
本课题通过生物信息学研究还发现肺腺癌转移相关转录物1，lncRNAMALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，)与ANXA2互为竞争性内源RNA(ceRNA)，在PDAC组织中表达呈正相关。研究证实，在HEK293T细胞中敲低MALAT1后，ANXA2荧光酶活性下调。有意思的是，MALAT1与miR-23b-3p存在有4个结合位点，两者表达在乳腺癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌等恶性肿瘤中均呈负相关。本课题组前期发现在PDAC石蜡包埋组织中，MALAT1呈低表达，其表达与PDAC肿瘤大小，浸润深度，临床分期及预后密切相关。shRNA沉默MALALT1后，PDAC细胞增殖、侵袭及迁移能力减弱，凋亡增加。miR-23b-3p与MALAT1在PDAC中是否存在结合并调控关系？至今也未见相关文献报道。
我们推测miR-23b-3p可能对PDAC的生物学功能产生影响；MALAT1可能通过下调miR-23b-3p表达，调控其下游靶基因ANXA2，从而参与PDAC发生、发展的过程。因此，本课题侧重研究miR-23b-3p对PDAC生物学功能的影响；miR-23b-3p通过潜在靶基因ANXA2调控PDAC恶性进展的机制；在PDAC中，miR-23b-3p与MALAT1之间的调控关系。为此，实验分三部分进行：
第一部分miR-23b-3p在PDAC中的生物学功能研究
材料和方法
1.使用miR-23b-3pmimic(模拟物)、inhibitor(抑制物)转染Bxpc-3、Panc-1 两株PDAC细胞。采用RT-qPCR检测miR-23b-3p表达情况。
2.通过CCK-8实验、平板克隆、划痕实验、transwell、流式细胞术检测转染miR-23b-3p后，对PDAC细胞的增殖、侵袭、凋亡以及细胞周期分布等的影响。
3.构建鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)成瘤模型，探讨miR-23b-3p对PDAC肿瘤形成的影响。
结果
1.体外实验表明，过表达miR-23b-3p后，PDAC细胞的增殖活性减弱(P＜0.01)，克隆形成率也较对照组明显减少(P＜0.05)，并将细胞周期阻滞于G0/G1期(P＜0.05)；平面迁移能力减弱(P＜0.05)，迁移及侵袭到小室下室的细胞数量减少(P＜0.01)。而抑制miR-23b-3p表达则结果相反，相对于对照组，PDAC细胞增殖活性增强(P＜0.01)、克隆形成率增加(P＜0.05)，迁移及侵袭到小室下室的细胞数量增多(P＜0.05)。而过表达miR-23b-3p后并未能对PDAC凋亡造成显著影响(P＞0.05)。
2.体内CAM成瘤实验结果显示，过表达miR-23b-3p可使PDAC移植瘤大小明显减小(P＜0.05)。
第二部分miR-23b-3p通过靶基因ANXA2调控PDAC恶性进展的机制研究
材料和方法
1.使用生物信息学分析miR-23b-3p与ANXA2相关性
2.使用双荧光素酶报告基因实验，验证miR-23b-3p与ANXA2的结合及靶向关系。
3.转染miR-23b-3p后，使用RT-qPCR检测ANXA2mRNA的表达。
4.通过westernblot验证miR-23b-3p对ANXA2的调控关系，以及对EMT进程关键因子ZEB1的影响。
5.采用免疫组织化学法，在40例PDAC组织、16例癌旁组织中检测ANXA2 蛋白表达，分析其与miR-23b-3p表达的相关性。
结果
1.生物信息学分析发现，miR-23b-3p与ANXA2在多种恶性肿瘤中表达呈负相关。
2.双荧光素酶基因报告发现，与空载对照组相比，共转染miR-23b-3p组的ANXA2-3’UTR-WT相对荧光酶活性下降(P＜0.05)，而miR-23b-3p与ANXA2-3’UTRMUT共转转染组,荧光酶活性无明显变化(P＞0.05)。
3.在PDAC细胞系中过表达miR-23b-3p后，ANXA2mRNA表达(P＜0.05)及蛋白水平下调。
4.ANXA2蛋白在PDAC组织中呈高表达，并且与肿瘤大小(r=0.379，P=0.024)、TNM晚期(r=0.401，P=0.021)、神经浸润(r=0.36，P=0.042)、生存时间(r=-0.36，P=0.042)相关。使用Spearman相关分析发现，miR-23b-3p的表达量与ANXA2免疫组化染色评分呈负相关关系(r=-0.402，P=0.010)
第三部分miR-23b-3p与MALAT1在PDAC中的靶向调控关系的研究
材料和方法
1.使用生物信息学分析miR-23b-3p与MALAT1相关性
2.采用CRISPR/Cas9技术在Bxpc-3细胞中对MALAT1进行敲除。使用genomicPCR、RT-qPCR对敲除效率进行鉴定。
3.在敲除MALAT1的Bxpc-3细胞中，使用RT-qPCR检测miR-23b-3p表达，探讨MALAT1是否对miR-23b-3p存在调控作用。
4.构建miR-23b-3p与MALAT1结合位点表达质粒，并转染至已敲除MALAT1的Bxpc-3细胞中。
5.使用RT-qPCR对miR-23b-3p表达进行检测，明确MALAT1是否通过该位点对miR-23b-3p进行调控。
6.在胰腺癌Panc-1细胞中瞬时转染miR-23b-3pmimic、inhibitor，RT-qPCR 检测MALAT1表达，初步研究miR-23b-3p对MALAT1的调控。
7.使用Bxpc-3细胞，构建miR-23b-3p稳定过表达PDAC细胞株，并检测MALAT1表达，研究在PDAC中，miR-23b-3p对MALAT1的调控。
结果
1.使用CRISPR/Cas9技术在Bxpc-3中敲低MALAT1后(P＜0.01)，miR-23b-3p表达出现上调(P＜0.05)。
2.在PADC细胞中敲低MALAT1后，转染与miR-23b-3p结合位点的表达质粒，miR-23b-3p表达出现下调(P＜0.05)。
3.在PDAC细胞Panc-1中瞬时转染miR-23b-3pmimic后，MALAT1表达下调(P＜0.05)；而转染inhibitor则结果相反，MALAT1表达上调(P＜0.05)。在稳定表达miR-23b-3p的PDAC细胞Bxpc-3中，MALAT1表达同样出现下调(P＜0.05)。
结论
1.结合课题组前期研究结果，miR-23b-3p在PDAC组织和细胞中呈低表达，过表达miR-23b-3p可抑制PDAC细胞增殖、侵袭能力。
2.miR-23b-3p通过调控靶基因ANXA2，从而抑制PDAC的恶性进展。
3.miR-23b-3p与MALAT1结合并相互调控，MALAT1可抑制miR-23b-3p在PDAC中的表达。
4.再次明确CRISPR/Cas9dual-gRNA技术可高效、准确的在肿瘤细胞中敲除lncRNA。
5.MALAT1/miR-23b-3p/ANXA2通路可能在PDAC的发生发展中发挥重要作用，但仍需进一步研究证实。该通路可为PDAC发生发展的机制研究提供新思路。
非编码RNA(noncoding RNAs)在人类基因组转录生成物中约占98%，不具有编码蛋白的功能。根据其长度可分为长链非编码RNA(long noncoding RNAs ， lncRNA)及小非编码RNA(small noncoding RNAs,sncRNA )。microRNA(miRNA)是一类长度为18-25nucleotide(nt)的非编码小分子RNA。研究证实，miRNA参与人类生长、发育等过程，并涉及神经系统、心血管系统、炎症、肿瘤等疾病的发生发展。lncRNA长度大于200nt，现已有13000个lncRNA被确认，超过人类基因数量20%(GENCODE version 17)。lncRNA在肿瘤、神经系统等疾病中作为关键的调节因子发挥作用。大量研究发现miRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，其作用机制除了与靶基因mRNA结合外，还可通过与lncRNA的相互作用在肿瘤发生发展中的发挥功能。
miR-23b-3p过去曾命名为miR-23b，本课题组前期发现，miR-23b-3p 在PDAC癌石蜡包埋组织及细胞系中低表达，并且miR-23b-3p低表达组肿瘤体积大、浸润深，以及特异性生存期较短。根据生物信息学预测，发现miR-23b-3p与膜联蛋白A2(annexin A2，ANXA2)存在结合位点。已有研究发现ANXA2在PDAC中呈高表达，可增强PDAC细胞的侵袭以及抗凋亡能力，并可促进PDAC细胞的上皮间质转化(EMT)进程。而miR-23b-3p对PDAC的生物学功能影响、miR-23b-3p与ANXA2在PDAC中的调控关系等均未见相关报道。
本课题通过生物信息学研究还发现肺腺癌转移相关转录物1，lncRNAMALAT1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，)与ANXA2互为竞争性内源RNA(ceRNA)，在PDAC组织中表达呈正相关。研究证实，在HEK293T细胞中敲低MALAT1后，ANXA2荧光酶活性下调。有意思的是，MALAT1与miR-23b-3p存在有4个结合位点，两者表达在乳腺癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌等恶性肿瘤中均呈负相关。本课题组前期发现在PDAC石蜡包埋组织中，MALAT1呈低表达，其表达与PDAC肿瘤大小，浸润深度，临床分期及预后密切相关。shRNA沉默MALALT1后，PDAC细胞增殖、侵袭及迁移能力减弱，凋亡增加。miR-23b-3p与MALAT1在PDAC中是否存在结合并调控关系？至今也未见相关文献报道。
我们推测miR-23b-3p可能对PDAC的生物学功能产生影响；MALAT1可能通过下调miR-23b-3p表达，调控其下游靶基因ANXA2，从而参与PDAC发生、发展的过程。因此，本课题侧重研究miR-23b-3p对PDAC生物学功能的影响；miR-23b-3p通过潜在靶基因ANXA2调控PDAC恶性进展的机制；在PDAC中，miR-23b-3p与MALAT1之间的调控关系。为此，实验分三部分进行：
第一部分miR-23b-3p在PDAC中的生物学功能研究
材料和方法
1.使用miR-23b-3pmimic(模拟物)、inhibitor(抑制物)转染Bxpc-3、Panc-1 两株PDAC细胞。采用RT-qPCR检测miR-23b-3p表达情况。
2.通过CCK-8实验、平板克隆、划痕实验、transwell、流式细胞术检测转染miR-23b-3p后，对PDAC细胞的增殖、侵袭、凋亡以及细胞周期分布等的影响。
3.构建鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)成瘤模型，探讨miR-23b-3p对PDAC肿瘤形成的影响。
结果
1.体外实验表明，过表达miR-23b-3p后，PDAC细胞的增殖活性减弱(P＜0.01)，克隆形成率也较对照组明显减少(P＜0.05)，并将细胞周期阻滞于G0/G1期(P＜0.05)；平面迁移能力减弱(P＜0.05)，迁移及侵袭到小室下室的细胞数量减少(P＜0.01)。而抑制miR-23b-3p表达则结果相反，相对于对照组，PDAC细胞增殖活性增强(P＜0.01)、克隆形成率增加(P＜0.05)，迁移及侵袭到小室下室的细胞数量增多(P＜0.05)。而过表达miR-23b-3p后并未能对PDAC凋亡造成显著影响(P＞0.05)。
2.体内CAM成瘤实验结果显示，过表达miR-23b-3p可使PDAC移植瘤大小明显减小(P＜0.05)。
第二部分miR-23b-3p通过靶基因ANXA2调控PDAC恶性进展的机制研究
材料和方法
1.使用生物信息学分析miR-23b-3p与ANXA2相关性
2.使用双荧光素酶报告基因实验，验证miR-23b-3p与ANXA2的结合及靶向关系。
3.转染miR-23b-3p后，使用RT-qPCR检测ANXA2mRNA的表达。
4.通过westernblot验证miR-23b-3p对ANXA2的调控关系，以及对EMT进程关键因子ZEB1的影响。
5.采用免疫组织化学法，在40例PDAC组织、16例癌旁组织中检测ANXA2 蛋白表达，分析其与miR-23b-3p表达的相关性。
结果
1.生物信息学分析发现，miR-23b-3p与ANXA2在多种恶性肿瘤中表达呈负相关。
2.双荧光素酶基因报告发现，与空载对照组相比，共转染miR-23b-3p组的ANXA2-3’UTR-WT相对荧光酶活性下降(P＜0.05)，而miR-23b-3p与ANXA2-3’UTRMUT共转转染组,荧光酶活性无明显变化(P＞0.05)。
3.在PDAC细胞系中过表达miR-23b-3p后，ANXA2mRNA表达(P＜0.05)及蛋白水平下调。
4.ANXA2蛋白在PDAC组织中呈高表达，并且与肿瘤大小(r=0.379，P=0.024)、TNM晚期(r=0.401，P=0.021)、神经浸润(r=0.36，P=0.042)、生存时间(r=-0.36，P=0.042)相关。使用Spearman相关分析发现，miR-23b-3p的表达量与ANXA2免疫组化染色评分呈负相关关系(r=-0.402，P=0.010)
第三部分miR-23b-3p与MALAT1在PDAC中的靶向调控关系的研究
材料和方法
1.使用生物信息学分析miR-23b-3p与MALAT1相关性
2.采用CRISPR/Cas9技术在Bxpc-3细胞中对MALAT1进行敲除。使用genomicPCR、RT-qPCR对敲除效率进行鉴定。
3.在敲除MALAT1的Bxpc-3细胞中，使用RT-qPCR检测miR-23b-3p表达，探讨MALAT1是否对miR-23b-3p存在调控作用。
4.构建miR-23b-3p与MALAT1结合位点表达质粒，并转染至已敲除MALAT1的Bxpc-3细胞中。
5.使用RT-qPCR对miR-23b-3p表达进行检测，明确MALAT1是否通过该位点对miR-23b-3p进行调控。
6.在胰腺癌Panc-1细胞中瞬时转染miR-23b-3pmimic、inhibitor，RT-qPCR 检测MALAT1表达，初步研究miR-23b-3p对MALAT1的调控。
7.使用Bxpc-3细胞，构建miR-23b-3p稳定过表达PDAC细胞株，并检测MALAT1表达，研究在PDAC中，miR-23b-3p对MALAT1的调控。
结果
1.使用CRISPR/Cas9技术在Bxpc-3中敲低MALAT1后(P＜0.01)，miR-23b-3p表达出现上调(P＜0.05)。
2.在PADC细胞中敲低MALAT1后，转染与miR-23b-3p结合位点的表达质粒，miR-23b-3p表达出现下调(P＜0.05)。
3.在PDAC细胞Panc-1中瞬时转染miR-23b-3pmimic后，MALAT1表达下调(P＜0.05)；而转染inhibitor则结果相反，MALAT1表达上调(P＜0.05)。在稳定表达miR-23b-3p的PDAC细胞Bxpc-3中，MALAT1表达同样出现下调(P＜0.05)。
结论
1.结合课题组前期研究结果，miR-23b-3p在PDAC组织和细胞中呈低表达，过表达miR-23b-3p可抑制PDAC细胞增殖、侵袭能力。
2.miR-23b-3p通过调控靶基因ANXA2，从而抑制PDAC的恶性进展。
3.miR-23b-3p与MALAT1结合并相互调控，MALAT1可抑制miR-23b-3p在PDAC中的表达。
4.再次明确CRISPR/Cas9dual-gRNA技术可高效、准确的在肿瘤细胞中敲除lncRNA。
5.MALAT1/miR-23b-3p/ANXA2通路可能在PDAC的发生发展中发挥重要作用，但仍需进一步研究证实。该通路可为PDAC发生发展的机制研究提供新思路。