柑橘中柚类（Citrus maxima）普遍具有自交不亲和现象,即拒绝自我的（或相同S基因型）花粉在柱头上生长,抑制其到达花柱底部,避免授粉受精。自交不亲和现象常见于显花植物中,意在促进异交,防止自交衰退,保持物种遗传多样性。课题组前期研究表明柚自交不亲和属于典型的S-RNase介导的配子体型自交不亲和,控制其自交不亲和的关键雌蕊决定因子是S-RNase,但与S-RNase互作的下游互作蛋白至今未有报道。基于此,本实验拟利用高班柚花粉构建酵母文库,利用酵母双杂交系统筛选得到与S-RNase互作的蛋白,并结合离体蛋白互作实验进行验证,为深入解析柚自交不亲和分子机制奠定基础。主要研究成果如下:1.利用高班柚花粉c DNA构建酵母文库,筛选出约200个候选基因,根据注释及相关文献报导对其中的7个候选基因进行进一步的验证,候选基因分别为Cg E3（泛素连接酶RIN2）,Cg CR（富含半胱氨酸的蛋白）,Cg CP（半胱氨酸蛋白酶）,Cg ATPase（腺嘌呤核苷酸水解酶）,Cg CT（转运蛋白）,Cg GLT（半乳糖苷酶）,Cg EXP（扩张蛋白）。2.通过酵母点对点验证以及Pull-down实验确定Cg CP（半胱氨酸蛋白酶）与S1-RNase互作;通过亚细胞定位实验发现Cg CP在细胞核和内质网上均有表达;通过q RT-PCR实验及转录组数据分析表明Cg CP在花粉组织中特异性高表达;3.通过氨基酸序列及结构域分析发现Cg CP具有蛋白水解酶的相关结构域,且功能相对比较保守,基于晚白柚基因组分析,发现柚中含有12个半胱氨酸蛋白酶同源基因,除Cg CP和未扩增出的一个同源基因,其余10个同源基因通过酵母双杂交实验验证均不与S-RNase互作;4.通过扩增沙田柚和沙田柚的自交亲和变异品种桂柚中的Cg CP基因,发现在基因的3’末端区域,沙田柚的Cg CP序列比桂柚（GY）少了约170bp的序列,造成Cg CP氨基酸序列短缺。综上所述,本研究筛选到与S-RNase互作的下游基因Cg CP,初步探究了Cg CP在柚中的表达模式,推测其在自交不亲和反应中可能参与花粉细胞骨架解聚并诱导细胞程序性死亡,为深入解析柚自交不亲和分子机制奠定基础。