柑橘是世界最重要的水果之一。体细胞胚发生（Somatic embryogenesis,SE）是柑橘种质资源保存和生物技术育种的重要再生途径。然而,随着继代年限增加,愈伤组织的体细胞胚发生能力逐渐减弱难以再生,限制了柑橘生物技术发展。明晰体细胞胚发生机理对提高愈伤组织再生效率具有重要意义。本课题组前期通过愈伤组织遗传转化验证miR156及其靶基因Cs SPLs（SQUAMOSA PROMOTER BINDING LIKE）调控柑橘体细胞胚发生,并筛选到Cs SPL14的互作蛋白AKIN10（SNF1-related protein kinase catalytic subunit alpha KIN10）。高通量组学筛选到miR171也是柑橘体细胞胚发生的关键因子。为了构建miR156和miR171调控柑橘体细胞胚发生的调控路径,本课题通过酵母单杂交筛库发掘miR156和miR171上游调控基因;在愈伤组织超量表达AKIN10,验证其调控柑橘体细胞胚发生的功能。主要研究结果如下:1.通过酵母单杂交（Y1H）筛选miR156和miR171上游调控基因并明确调控作用。将miR156和miR171启动子连入酵母诱饵载体中,在柑橘酵母文库中筛选可能与其互作的基因。酵母单杂交共筛选到4个转录因子可能和miR156互作,5个转录因子可能和miR171互作。参考前人报道的与miR156和miR171启动子区结合的转录因子,酵母点对点和双荧光素酶（LUC）证明BPC6、WRKY7、AGL15、FUS3和NFYB8均促进MIR156启动子表达,而BPC6、SCL2/3促进MIR171启动子表达。2.利用凝胶迁移（EMSA）进一步验证AGL15和FUS3与miR156启动子互作。将FUS3-HIS、AGL15-HIS重组蛋白和MIR156启动子标记探针孵育后检测到明显的互作条带,在此体系中加入梯度浓度的未标记探针,互作条带变弱直至消失。同样条件下,蛋白与突变探针孵育后检测不到互作条带,证明AGL15、FUS3与MIR156启动子互作,且结合位点为分别为CAr G（CATAAATG）和RY motif（TGCATG）。3.AKIN10促进柑橘体细胞胚发生。在伏令夏橙愈伤组织中超表达Cs AKIN10,甘油培养基诱导体细胞胚发生试验结果表明,超表达系的体细胞胚发生能力显著高于空载转化系和野生型愈伤。综上所述,本研究筛选了6个与miR156和miR171启动子互作的转录因子,验证了miR156下游互作蛋白Cs AKIN10促进体细胞胚发生,为解析miRNA调控柑橘体细胞胚发生的路径提供了候选基因和线索。