生物膜系统的稳态维持关系到细胞的存活与死亡，多种细胞程序性死亡过程伴随着细胞膜及内膜系统的崩解，而不同膜系统的崩解过程由特定的蛋白所介导。Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡中线粒体外膜(MOM)通透重要的介导蛋白。其中Bid蛋白在被蛋白酶剪切激活后不仅可以活化与其同家族的Bax/Bak，使其在MOM上形成孔道，Bid自身也可以引起细胞内多种膜结构的通透，包括线粒体和溶酶体。本实验室的前期工作中从蛋白与膜脂相互作用的角度系统研究Bid蛋白与溶酶体的作用机制，率先发现活化的Bid蛋白即tBid可以通过与酸性磷脂磷脂酸(Phosphatidic acid, PA)相互作用而介导溶酶体膜通透。但囿于技术手段的限制，我们的前期工作并未阐明tBid如何特异性地与磷脂酸相互作用，也没有从蛋白结构的角度解析tBid在磷脂酸作用下与溶酶体膜发生相互作用后发生构象变化的精细过程。随着单分子荧光技术的飞速发展，这一先进技术正成为研究生物大分子结构动态变化的有力工具。本论文在实验室前期工作基础上，系统研究了tBid与磷脂酸相互作用的机制，并利用单分子荧光的方法进一步解析了tBid与膜作用过程的构象变化，并取得了如下研究结果:　　首先，我们发现位于tBid疏水核心的第6个α螺旋(H6)在蛋白与PA相互作用中发挥关键作用。位于H6上第157位、第158位的赖氨酸是tBid与PA作用所必需的。31P固体核磁的结果显示，K157及K158可以促进PA磷酸头部第二个质子的解离，进而增强蛋白与PA的静电相互作用。为了研究tBid与膜相互作用过程中的构象变化，我们选取了tBid中关键结构域BH3以及位于疏水核心的H6、H7相关的氨基酸位点进行半胱氨酸突变，以实现对这些位点进行特异性的荧光标记，并检测了这些突变对tBid活性的影响，结果表明突变蛋白的活性与野生型没有显著差异。对所得的突变蛋白进行四甲基罗丹明标记，得到位点特异的荧光标记蛋白。进一步应用单分子薄膜引起的表面荧光衰逝(SingleMolecule Surface Induced Fluorescence Attenuation，sm-SIFA)单个荧光标记蛋白在磷脂膜内的空间位置进行了动态追踪，结果表明，当蛋白浓度很低、蛋白处于单体状态时， tBid的7个螺旋均平躺于磷脂膜表面，其中位于疏水核心的H6，H7与其他螺旋相比，略进入膜内约0.6nm随着蛋白浓度的增高，tBid出现了明显的寡聚化行为，并伴随有H6、H7在膜表面的摆动;这一摆动对膜的完整性造成扰动，甚至造成膜结构的缺陷，使得一些分子得以穿过膜屏障。　　鉴于溶酶体膜通透与细胞凋亡密切相关，我们试图找到可以靶向溶酶体的小分子药物，以阻断细胞凋亡。实验室前期的研究结果表明维生素E衍生物EseroS-GS对氧化应激引起的细胞死亡具有显著的保护作用。与其它具有更强抗氧化功能的抗氧化剂如Trolox相比，EseroS-GS呈现出更强的细胞保护效应，因此我们推测除清除活性氧之外，EseroS-GS还可通过其他机制保护细胞。通过免疫荧光成像及流式细胞分析，我们发现EseroS-GS可以显著抑制氧化应激介导的溶酶体膜通透，从而阻断细胞凋亡。　　Bid是介导细胞凋亡过程中溶酶体膜通透的关键蛋白之一，因此我们进一步研究了EseroS-GS对Bid蛋白的作用。结果显示，EseroS-GS可以显著抑制tBid与溶酶体的结合，降低其插膜及寡聚化，从而稳定溶酶体、抑制细胞凋亡。溶酶体膜通透伴随着众多内含的水解酶释放到胞质中，我们检测了溶酶体膜通透引起细胞死亡的机制，结果显示溶酶体中的胰凝乳蛋白酶参与到氧化应激引起的细胞死亡中，过表达胰凝乳蛋白酶可以显著增强由氧化应激引起的细胞死亡，同理，通过RNA干扰降低胰凝乳蛋白酶的表达量会减少细胞死亡;进一步，我们发现胰凝乳蛋白酶可以通过剪切激活Bid蛋白，参与到溶酶体膜通透过程中，胰凝乳蛋白酶具有剪切Bid的活性，所得的剪切产物chymBid与凋亡酶凋亡酶8剪切所得剪切产物tBid相比，具有更强的引起溶酶体膜通透的活性。为此我们提出EseroS-GS通过保护溶酶体减少氧化应激引起神经细胞死亡的机制:在氧化压力刺激下，凋亡酶凋亡酶8会被活化，从而剪切Bid蛋白成tBid而活化，tBid蛋白在溶酶体上PA的作用下与溶酶体结合并发生构象变化插入溶酶体膜引起溶酶体膜通透，释放出溶酶体内含的多种水解酶，其中，胰凝乳蛋白酶可以剪切激活Bid形成具有更高活性的chymBid引起更多的溶酶体膜发生通透，从而放大凋亡信号，最终引起细胞的死亡;具有抗氧化作用的EseroS-GS加入，一方面可以清除氧化压力，减少凋亡酶凋亡酶8的活化，另一方面EseroS-GS可以抑制tBid与溶酶体的结合，减少胰凝乳蛋白酶的释放，减少chymBid对氧化应激引起的凋亡信号的放大，从而显著减少氧化应激引起的细胞死亡。　　综上所述，我们通过一系列实验揭示了tBid与溶酶体膜上的磷脂酸PA相互作用的分子机制，并通过单分子荧光的方法研究了tBid与磷脂膜作用过程中的构象变化，为进一步研究tBid的成孔机制提供依据。同时我们还发现了具有抗氧化作用的EseroS-GS通过抑制tBid与溶酶体的结合稳定溶酶体，减少溶酶体内的胰凝乳蛋白酶的释放，从而减少胰凝乳蛋白酶对Bid的剪切激活，抑制chymBid对氧化应激引起的凋亡信号的正反馈放大，最终防止细胞死亡。