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阿魏酸酯酶是半纤维素降解酶系中重要的组成成分之一,因为其可水解酯键,醚键和木聚糖链或与木质素成分上的阿魏酸连接键,可与聚合物共同组成的稳定的三维结构,阿魏酸酯酶可以将这聚合物上面连接的阿魏酸残基切下来,致使生成的长链变得更短、分支变得更少,最后打破了结构的稳定性。所以除了应用在食品制浆、造纸和生物合成之外,还可以在生物质的水解等生物能源等方面具有广泛的应用价值。阿魏酸酯酶的酶活力,分泌量等很多方面仍具有较大的改造空间,至今还没有大规模的应用于工业生产中,因此阿魏酸酯酶基因的高效表达方面仍具有巨大潜在的应用价值。本实验室桧状青霉基因组测序后,发现一个序列较新的阿魏酸酯酶(数据未公开),对其性质与功能有待进行深入研究。目前常用纤维素酶系产生菌里氏木霉不向胞外分泌阿魏酸酯酶,我们希望通过构建高效表达阿魏酸酯酶的黑曲霉菌株后复配平衡里氏木霉的酶系,提高对纤维素的降解能力。本研究首先利用分子生物学方法中的PCR技术扩增了来源于桧状青霉中的新颖的阿魏酸酯酶基因,构建了真菌表达载体p SIMPLE-19-Pp FAE。通过原生质体介导法转化黑曲霉,筛选异源重组转化子。然后对异源重组转化子黑曲霉的发酵上清液进行阿魏酸酯酶酶活测定,经过SDS-PAGE结果分析,新发现的阿魏酸酯酶在黑曲霉中进行成功的异源表达。新型阿魏酸酯酶的酶学性质和生物质降解方面的新功能进行深入研究,其次利用荧光定量PCR技术筛选出阿魏酸酯酶最佳的诱导物组合,从而实现了该新型阿魏酸酯酶在黑曲霉中高效表达,经过重新复配里氏木霉的酶系后,可大幅度提高里氏木霉现有酶系的水解效率。本研究主要从以下4个方面展开:1.黑曲霉表达载体p SIMPLE-19-Pp FAE的构建以桧状青霉阿魏酸酯酶的DNA为模板,利用设计好的引物,通过PCR扩增获得阿魏酸酯酶基因。将获得的基因片段和真菌表达质粒p SIMPLE-19先经过双酶切,再利用T4链接酶将片段和质粒连接,最后成功构建好新型阿魏酸酯酶在黑曲霉中表达盒p SIMPLE-19-Pp FAE。2.异源重组转化子的筛选鉴定将构建好的真菌表达盒p SIMPLE-19-Pp FAE转入黑曲霉原生质体中,运用菌落PCR技术筛选转化子,PCR结果显示菌落PCR扩增出与目的条带一样大小的条带,证明新型阿魏酸酯酶在黑曲霉中成功转入,得到了异源表达的转化子。3.阿魏酸酯酶在黑曲霉中的表达以阿魏酸甲酯为底物,测定阿魏酸酯酶酶活性,结果表明该阿魏酸酯酶酶活力高达22.02 IU/mg。取发酵上清液进行SDS-PAGE检测,结果显示在53KDa处可见明显的目的条带。接着切割SDS-PAGE蛋白条带进行二级质谱鉴定,结果证实此蛋白是一种新型的阿魏酸酯酶蛋白,证明了在黑曲霉中成功异源表达了一种新型高效阿魏酸酯酶。4.荧光定量PCR筛选新颖阿魏酸酯酶最佳诱导物利用不同诱导物诱导新型阿魏酸酯酶表达,并运用荧光定量PCR技术分析在不同诱导物条件下新型阿魏酸酯酶的转录差异情况,确定了该新型阿魏酸酯酶的最佳诱导物。5.与里氏木霉酶液的协同实验利用黑曲霉中异源表达的阿魏酸酯酶复配现有常见酶系-里氏木霉酶系,大幅度提升里氏木霉的水解效率,生物质转化效率大幅度提高。综上所述:基于以上的研究结果,近一步研究阿魏酸酯酶的结构和性质,有助于后续研究的近一步开展。