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固有免疫是机体抵抗外来病原体入侵的第一道防线。机体内的模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）可以识别不同病原相关分子模式（pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs）并通过一系列接头分子向下传递激活信号,促进Ⅰ型干扰素（interferon,IFN）和炎性细胞因子的产生。TANK结合激酶1（TANK-bindingkinase 1,TBK1）是IFN-β信号通路中的重要接头分子,在DNA病毒及RNA病毒感染中都发挥着重要功能。接收到上游的活化信号后,TBK1可以发生自身磷酸化并进行活化信号的传导。但TBK1的活化调控机制目前仍不清楚。蛋白质翻译后修饰是蛋白质活性调控的重要形式,磷酸化、泛素化、乙酰化等修饰形式均已被报道在天然免疫中发挥重要功能,但其他修饰形式仍待进一步研究。精氨酸甲基化修饰是一种机体内普遍存在的蛋白质翻译后修饰形式,由蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferases,PRMTs）家族成员催化完成。近年来,越来越多的研究表明精氨酸甲基化修饰在抗病毒免疫中发挥重要功能。PRMT1是Ⅰ型PRMTs家族成员。据报道,细胞中90%以上的精氨酸甲基化修饰都是由PRMT1催化完成,但其在抗病毒免疫中的功能报道较少。在本研究中,我们通过对PRMT1家族的功能性筛选实验,发现敲低PRMT1的表达量可以显著抑制由SeV感染引起的Ifnb1的表达。利用Prmt1fl/fl及Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的腹腔巨噬细胞进行实验,发现在加入多种不同的IFN-β信号通路的刺激剂处理细胞后,Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的腹腔巨噬细胞中Ifnb1的mRNA表达水平及IFN-β的分泌水平均显著低于对照组。说明PRMT1正向调控IFN-β的表达。IFN-β对于机体的抗病毒免疫至关重要,为了确定PRMT1的抗病毒功能,我们利用VSV及HSV-1病毒感染了小鼠的腹腔巨噬细胞,并检测了病毒的复制情况。结果显示,Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的腹腔巨噬细胞中VSV及HSV-1病毒的复制量显著高于对照组。随后,我们构建了小鼠病毒感染模型。小鼠尾静脉注射VSV或HSV-1后,检测到Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的死亡率显著高于Prmt1fl/fl小鼠。取VSV或HSV-1病毒感染8 h的小鼠血清,检测到Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的血清中IFN-β的分泌量显著低于对照组。进一步的研究发现,VSV病毒感染后,Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的肝、脾及肺中VSV病毒的含量显著高于对照组。取HSV-1感染的小鼠脑组织,检测到Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的脑组织中HSV-1病毒的复制量显著高于对照组。以上结果说明,在DNA病毒及RNA病毒感染的过程中,PRMT1正向调控小鼠内源的抗病毒免疫反应。为了进一步探究PRMT1的功能,我们检测了PRMT1对IFN-β信号通路活化的影响。结果显示SeV及HSV-1感染后,Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的巨噬细胞中TBK1及IRF3的磷酸化水平较对照组显著降低。进一步的研究发现,PRMT1可以促进由TRIF、cGAS+STING、MAVS及TBK1诱导的IFN-β的表达;但对IRF3-5D引起的IFN-β的表达没有明显影响。以上结果表明PRMT1可能通过靶向TBK1促进IFN-β信号通路的活化。为了验证这一假设,我们利用免疫共沉淀技术检测了 PRMT1与TBK1的结合情况。结果表明,PRMT1与TBK1之间存在结合作用,并且病毒感染可以使两者的结合增强。利用TBK1的截短体进行实验,发现PRMT1与TBK1的N端结构域结合。为了探究PRMT1对IFN-β信号通路的调控是否依赖其甲基转移酶活性,我们在小鼠腹腔巨噬细胞的培养过程中添加了PRMT1的酶活抑制剂MS023。MS023可以显著抑制病毒感染引起的IFN-β信号通路的活化和Ifnb1的表达。说明PRMT1依赖其甲基转移酶活性调控抗病毒天然免疫反应。因此,我们检测了TBK1的甲基化修饰情况。在HEK293T细胞中过表达Flag-PRMT1,检测到TBK1的甲基化修饰显著增强。体外甲基化实验结果证实,PRMT1可以介导TBK1的非对称二甲基化修饰。为了确定TBK1的甲基化修饰位点,我们构建了一系列TBK1精氨酸位点突变体。发现当TBK1激酶结构域的6个精氨酸位点发生突变时,TBK1的甲基化修饰水平显著降低。紧接着,我们检测了PRMT1对TBK1活化的影响。利用SeV及HSV-1病毒感染小鼠的腹腔巨噬细胞后,发现Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的腹腔巨噬细胞中TBK1的激酶活性明显低于对照组。体外磷酸化实验结果表明,PRMT1可以促进TBK1的磷酸化修饰。为了探究甲基化修饰对TBK1活化的影响,我们在HEK293T细胞中检测了 TBK1精氨酸突变体的磷酸化修饰水平。结果显示,54、134及228位精氨酸突变后,TBK1的磷酸化修饰水平受到显著抑制。在Tbk1-/-MEF细胞中回补TBK1精氨酸突变体质粒,发现与野生型TBK1相比,TBK1突变体的磷酸化水平显著降低。TBK1磷酸化依赖其不同二聚体的聚集。为了进一步探究PRMT1是否促进了TBK1的聚集,我们利用Native-PAGE检测了病毒感染后TBK1的聚集情况。结果显示,SeV及HSV-1感染后,Prmt1fl/fl Lyz2-Cre小鼠的腹腔巨噬细胞中TBK1聚集体的生成量明显少于对照组。体外实验结果显示,GST-PRMT1蛋白的添加促进了 His-TBK1的聚集。为了探究甲基化修饰在TBK1聚集过程中发挥的作用,我们在Tbk1-/-MEF细胞中进行了回补实验,结果表明,TBK1精氨酸突变体的聚集受到了显著抑制。综上所述,本研究发现病毒感染后,PRMT1可以通过靶向TBK1促进IFN-β信号通路的活化。PRMT1可以与TBK1的N端结构域结合并对其激酶结构域的54、134及228位精氨酸进行非对称二甲基化修饰。病毒感染后TBK1的甲基化修饰显著增强,该修饰通过促进TBK1聚集体的形成进而促进TBK1的反式自身磷酸化及下游IFN-β的生成。更重要的是,我们发现PRMT1髓系细胞特异性敲除小鼠在DNA病毒及RNA病毒感染后死亡率显著高于对照组小鼠。本研究揭示了精氨酸甲基化修饰在抗病毒天然免疫中的重要功能并为TBK1活化机制的研究开拓了新的方向。