第一部分先天性巨结肠狭窄段Doc2a基因表达下调目的:观察Doc2a基因在HSCR病理组织中的表达变化。方法:收集HSCR病人肠道组织及HSCR模型小鼠（Ednrb基因敲除小鼠）肠道组织,通过HE、Western blot、Realtime-quantitative PCR（RT-q PCR）、免疫荧光（Immunofluorescence,IF）等方法探索狭窄段Doc2a基因的表达变化。结果:一、Ednrb基因敲除小鼠作为HSCR的模型小鼠,被广泛接受,且Ednrb+/Ednrb+和Ednrb+/Ednrb-基因型小鼠的表型完全一致。Ednrb基因小鼠的鉴定和表型:Ednrb+/Ednrb+和Ednrb+/Ednrb-基因型小鼠需要进行鉴定,Ednrb-/Ednrb-基因型小鼠在长出毛发后呈白色花斑,可通过肉眼区分,并伴有典型HSCR症状。二、Western blot结果显示,在HSCR病人及HSCR模型小鼠的狭窄段,Tuj1和Doc2a的蛋白水平极低,基本无表达;RT-q PCR结果显示,HSCR病人及HSCR模型小鼠的狭窄段RNA水平极低,基本无表达;HE结果显示HSCR正常段可见正常神经元,移行段神经元数目减少,狭窄段无神经元;免疫荧光结果中,Tuj1标记肠神经元,Doc2a在正常段和移行段均有表达,在狭窄段无表达。结论:HSCR模型小鼠和HSCR病人狭窄段中Doc2a基因表达明显下调。第二部分Neuro-2a细胞系和肠神经嵴细胞中敲低Doc2a基因的表型研究目的:体外实验研究Doc2a基因下调对Neuro-2a细胞系和肠神经嵴细胞的影响。方法:构建模型:在Neuro-2a细胞系和原代肠神经嵴细胞中敲低Doc2a基因,通过sh RNA慢病毒转染、免疫荧光双标、CCK8增殖实验、流式周期实验、流式凋亡实验、Transwell迁移实验观察神经细胞的神经极性和神经纤维连接的变化情况,以及相应的细胞周期、增殖、凋亡、迁移能力的变化。结果:一、Neuoro-2a细胞系是体外研究神经元疾病的良好工具,而ENCCs是肠神经元的祖细胞。运用sh RNA慢病毒转染技术,能成功敲低Doc2a基因的表达。二、敲低Doc2a基因后:在Neuro-2a细胞免疫荧光实验中,Knock down组的突起数量明显增多,神经元极性增强;在CCK8增殖实验中,Knock down组细胞的增殖减慢;在流式周期和流式凋亡实验中,Knock down组细胞的凋亡率增加;在Transwell细胞迁移实验中,Knock down组细胞的迁移能力明显减弱。三、敲低Doc2a基因后:在ENCCs培养过程中发现,Knock down组的ENCCs分化加快,神经球极性增强,表现为神经球之间细小的神经纤维连接并交织成网状;对各组细胞的免疫荧光结果显示,Blank control和Negative control两组神经球很少贴壁分化,且神经纤维交织在神经球内部,而Knock down组神经球的神经纤维被Tuj1很好地显示出来,提示神经球贴壁分化明显,且发出神经纤维,在外部连接成网状。结论:Doc2a基因的下调能引起神经细胞的突起明显增多,神经纤维连接增加,神经元极性增强。这与先天性巨结肠狭窄段发生的副交感神经纤维和交感神经纤维大量增生并紊乱的现象相似。第三部分Doc2a及其蛋白互作分子在先天性巨结肠狭窄段的机制研究目的:初步探究Doc2a及其蛋白互作分子在先天性巨结肠狭窄段的作用机制。方法:在敲低Doc2a基因的细胞系和肠神经嵴细胞中以及HSCR病人和HSCR模型小鼠肠组织中,用RT-q PCR、Western blot技术检测Doc2a基因的密切作用分子的表达,并用Co-Immunoprecipitation（COIP）技术探索并验证Doc2a的下游作用分子。结果:一、在细胞系和ENCCs中发现,敲低Doc2a基因后,Snap25和Unc13a的RNA表达大约下调一半,Unc13b的RNA表达大约上调一倍。二、在HSCR病人和HSCR模型小鼠狭窄段中,Western blot结果显示,Unc13b的蛋白表达明显上调;RT-q PCR结果显示,Unc13b的RNA表达大约上调一倍。三、COIP实验中,对Doc2a和Unc13b的蛋白互作进行了正向和反向验证,结果显示,实验组和INPUT组均跑出同样的蛋白条带,说明Doc2a能与Unc13b发生蛋白互作,两者之间存在直接或间接效应。结论:Doc2a表达下调后,会引起Unc13b的上调,且Doc2a与Unc13b之间存在蛋白互作效应。因此我们猜测,HSCR狭窄段因各种遗传因素和环境因素引起Doc2a基因下调后,通过Unc13b的上调,激活某种兴奋性神经递质大量释放,引起先天性巨结肠的发生。