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目的:晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products, AOPP)是Witko-Sarsat等人于1996年首次报道的由尿毒症血液透析患者血浆中分离出的蛋白交联产物,作为氧化应激(oxidative stress, OS)新的标志物,是有一定生物学活性的促炎症反应介质。AOPP作为尿毒症毒素分子参与慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)和透析患者临床一些并发症发生的病理生理过程。本研究旨在通过人工合成晚期氧化蛋白产物-人血清白蛋白(AOPP-HSA)模型诱导体外培养的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells, HPMCs)对TGF-β1表达的影响及内源性活性氧(reactive oxygen species, ROS)在此过程中的调节机制,来探讨AOPP与维持性腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD)相关腹膜纤维化之间的关系,从而为临床防治腹膜纤维化提供理论依据。方法:采用Witko-Sarsat等介绍的方法,分别按照摩尔比为1/12.5、1/25、1/50、1/100将无内毒素的人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)与次氯酸溶液反应,体外制备出四种不同氧化修饰程度的AOPP-HSA模型。从CAPD治疗的CKD患者腹膜透析流出液中分离并在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中原代培养人腹膜间皮细胞,第二代细胞应用免疫组化方法进行细胞鉴定,第三代细胞用于实验,分别按照不同的实验要求分成浓度依赖组、时间依赖组、药物干预组。采用ELISA法检测HPMCs上清液中TGF-β1蛋白水平,采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量分析HPMCs中TGF-β1mRNA的基因表达水平,同时应用流式细胞仪检测细胞内对氧化剂敏感的2,7-二氢二氯荧光素(DCFH)发生氧化所产生的荧光量,从而间接的反映细胞内活性氧的生成水平。分别用不同浓度的抗氧化剂维生素E(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L),和N-乙酰半胱胺酸(0.1mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L)预处理细胞,观察抗氧化剂对HPMCs内源性ROS及TGF-β1表达的影响。结果:1. AOPP-HSA能显著诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1的分泌与基因表达,呈剂量依赖方式(P<0.01),在0-48h内TGF-β1的分泌与基因表达随时间的延长而增多,呈正相关关系(P<0.05),在48h达到高峰(P<0.01),随后出现降低。并且也与HSA/HOCL摩尔比成正相关关系(P<0.01)。2. AOPP-HSA也明显增加腹膜间皮细胞ROS的生成量,呈剂量依赖方式(P<0.01),在0、15、30min时间内平均荧光强度变化与时间呈依赖方式,在30min达到高峰(t=-26.073, P<0.01),随后在60min、120min内逐渐下降(t=-20.607、-11.813, P均<0.05)。并且也与HSA/HOCL摩尔比成正相关关系(P<0.01)。3.分别用不同浓度的抗氧化剂维生素E (12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)和N-乙酰半胱胺酸(0.1mmol/L、1.0mmol/L、10mmol/L)预处理细胞,与PBS对照组相比,可明显地降低细胞内ROS的生成量,同时显著地抑制AOPP-HSA诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1的分泌与基因表达,呈剂量依赖方式(P<0.01),其中维生素E (50μmol/L)组和NAC (10mmol/L)组抑制更加显著。4.未经HOCL修饰的HSA不能显著的诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1的分泌与基因表达及增加细胞ROS的生成量,与PBS对照组比较,无显著的统计学差异(P>0.05)。结论:1.体外制备的AOPP-HSA可显著诱导人腹膜间皮细胞TGF-β1的分泌与基因表达,部分可能通过内源性ROS介导细胞内信号转导途径调节此过程,提示AOPP可能通过增加体内氧化应激参与腹膜纤维化的形成过程。2.体外制备的AOPP-HSA可刺激人腹膜间皮细胞呼吸爆发,而抗氧化剂维生素E和N-乙酰半胱胺酸可显著降低细胞ROS的生成量。3.维生素E和N-乙酰半胱胺酸作为抗氧化剂通过清除细胞ROS而显著抑制TGF-β1的分泌与基因表达。4.此研究揭示抗氧化剂在防治腹膜纤维化发生、发展过程中可能是一种有效的药物,为抗氧化剂在临床上的应用提供可靠的理论依据。