研究背景与意义“药对”专指临床上常用且相对固定的两味中药配伍形式,是中药复方配伍中最简单、最常见的用药形式。其配伍符合中医“七情合和”理论之法度,具备复方的基本主治功能,为中医遣方用药特色之一,具有紧扣病机、功用专一、疗效确切等特点。“药有个性之特长,方有合群之妙用”,中药通过配伍组成方剂,或可以提高与改变疗效,或可以降低毒性与副作用,以适应复杂多变的病情。而中药复方配伍规律研究,是目前亟待解决的技术难题,从复方最小单位“药对”入手研究配伍规律,从易到难的研究思路,是复方研究的基础所在。麻黄-白术药对出自张仲景《金匮要略》中的“麻黄加术汤”,方中君药麻黄与白术(3：4)。功效：发汗解表,散寒除湿。主治：外感寒湿,恶寒发热,身体烦疼,无汗不渴,苔白腻,脉浮紧者。目前主要集中于类风湿性关节炎的研究。麻黄加术汤属于麻黄汤经方,麻黄白术药对组成规律遵循中医药“理法方药”治则。其理在于寒郁肌腠、湿滞筋骨、表阳被遏、营卫不通；其法为微汗法,既有发越阳之功,又有散寒除湿之能；药味组成包括麻黄(9g)、桂枝(6g)、炙甘草(3g)、杏仁(9g)、白术(12g)。目的结合前期麻黄-白术药对主要化学成分、药理效应及尿液代谢物研究工作基础,本课题以“麻黄加术汤”核心组成麻黄-白术药对为切入点,进行麻黄-白术配伍前后主要效应成分(麻黄类生物碱、白术内酯)的血浆药动学、组织分布和排泄研究,探讨麻黄-白术药对配伍规律,为药对配伍提供实验依据。方法1.麻黄-白术药对血浆药动学研究分别建立UPLC-MS/MS法,定量分析大鼠血浆中麻黄类生物碱(NME、 NMP、E、PE、ME)与白术内酯(AO-Ⅰ、AO-Ⅱ、AO-Ⅲ),完成方法学考察(基质效应、提取回收率、标准曲线、准确度与精密度、稳定性),应用于血浆药动学研究。采用SD大鼠,随机分为麻黄组、白术组、麻黄-白术(3：4)组。于给药后Omin、5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、48h,眼底静脉丛采血,血样预处理后进样分析,绘制药-时曲线图,并比较主要药动学参数。2.麻黄-白术药对组织分布研究建立UPLC-MS/MS法,测定大鼠组织中主要效应成分的含量。于给药后0.5h、1h、4h、8h、2h,取组织肝、心、脾、肺、肾和脑,将样品预处理后进样分析,并制作组织分布特征图。3.麻黄-白术药对排泄研究建立UPLC-MS/MS法,定量分析大鼠排泄物粪便和尿液中主要效应成分。于给药后0-2h、2-4h、4-6h、6-8h、8-12h、12-24h、24-36h,采集粪便,于给药后0-2h、2-4h、4-6h、6-8h、8-12h、12-24h、24-36h,分别采集尿液,样品预处理后进样分析,计算排泄物的总排泄率,并制作排泄物浓度分布特征图。4.数据统计的分析数据采集使用Agilent Mass Hunster Data Acquisition(Agilent Corp.USA);药动学参数分析使用DAS3.2.2软件,组织分布特征图、排泄物浓度分布特征图使用EXCEL作图软件；统计学分析使用SPSS13.0软件。结果所建立的定量分析方法均准确度良好,重现性好,可适用于测定大鼠血浆中、组织中和排泄物中麻黄类生物碱和白术内酯的含量。1.血浆药动学1.1麻黄与麻黄-白术(3：4)组1.1.1麻黄类生物碱的药-时曲线麻黄组与麻黄白术组NME、NMP、E、PE、ME吸收入血较快,5min即可检出,24h后低于检测限。配伍白术后,NME、NMP、E、PE、ME的Cmax均降低,且NME、NMP、E均出现双峰现象,其中E成分尤为明显。1.1.2药动学参数与麻黄组相比,麻黄-白术组NMP与PE的Tmax提前至0.75h,具有显著性差异(p<0.05),NME、E、ME的Tmax基本一致(p>0.05)；麻黄生物碱的Cmax均降低,但无显著性差异(p>0.05);t1/2、AUC均升高,具有显著性差异(p<0.05),CL降低,具有显著性差异(p<0.05)。1.2白术与麻黄-白术(3：4)组1.2.1白术内酯的药-时曲线白术组与麻黄-白术组中AO-Ⅰ, AO-Ⅱ, AO-Ⅲ均出现双峰现象,且吸收入血较快,5min即可检出,24h后低于检测限。1.2.2药动学参数与白术组相比,麻黄-白术组中AO-Ⅰ, AO-Ⅱ, AO-Ⅲ的AUC、Cmax均降低,无显著性差异(p>0.05);Tmax、t1/2、CL、V均升高,具有显著性差异(p<0.05)。2.组织分布2.1麻黄与麻黄-白术(3：4)组2.1.1麻黄类生物碱的组织分布特征麻黄组与麻黄白术组中麻黄类生物碱在肺脏中分布浓度最高,配伍增加麻黄生物碱在肺脏、脾脏分布。麻黄生物碱于给药后0.5h即可迅速分布到组织中,12h后浓度明显降低。麻黄生物碱在组织内含量分布：>PE>NME/NMP>ME■配伍后,NME、NMP、 E, PE, ME在肝脏、肾脏分布呈现降低趋势,在心脏、脾脏、肺脏分布呈现升高趋势,NME、NMP、E在脑内分布呈现降低趋势,PE、ME呈现升高趋势。2.2白术与麻黄-白术(3：4)组2.2.1白术内酯的组织分布特征白术组与麻黄白术组中白术内酯在脾脏、肺脏分布浓度最高,配伍后增加白术内酯在肺脏分布。白术内酯于给药后0.5h即可迅速分布到组织内,12h后分布浓度明显降低。白术内酯在组织内含量分布：AO-Ⅲ>AO-Ⅱ>AO-I。配伍后,AO-I、AO-Ⅱ、AO-Ⅲ在肝脏、心脏、脾脏分布呈现降低趋势,在脑内呈现升高趋势；AO-Ⅱ、AO-Ⅲ在肺脏分布呈现降低趋势,AO-Ⅰ呈现升高趋势；AO-Ⅰ、AO-Ⅲ在肾脏呈现降低趋势,AO-Ⅱ呈现升高趋势。白术组AO-Ⅰ与AO-Ⅱ均不能通过血脑屏障,麻黄-白术组AO-Ⅰ与AO-Ⅱ均可以通过血脑屏障,且脑内有较高浓度分布,尤以AO-Ⅱ明显。3.排泄研究3.1麻黄与麻黄-白术(3：4)组3.1.1麻黄类生物碱的粪便与尿液总排泄率(%)与麻黄组相比,麻黄-白术组麻黄生物碱的粪便总排泄率与尿液总排泄率均明显增加,具有显著性差异(p<0.05)。两组麻黄生物碱的尿液总排泄率均明显比粪便总排泄率大,E尤为明显,具有显著性差异p<0.01)。3.1.2粪便与尿液浓度分布特征与麻黄组相比,麻黄白术组麻黄生物碱在粪便中的分布浓度与在尿液中的分布浓度均明显增加；4-6h均为麻黄生物碱经粪便与经尿液排泄高峰期,36h后麻黄生物碱在粪便中低于检测限。两组麻黄生物碱在尿液中的分布浓度均明显比在粪便中的分布浓度大。3.2白术与麻黄-白术(3：4)组3.2.1白术内酯的粪便与尿液总排泄率(%)与白术组相比,麻黄-白术组AO-Ⅰ粪便总排泄率降低,具有显著性差异(p<0.05), AO-Ⅱ、AO-Ⅲ粪便总排泄率均增加,无显著性差异(p>0.05)；AO-Ⅰ,AO-Ⅱ, AO-Ⅲ的尿液总排泄率均降低,具有显著性差异p<0.05)。两组白术内酯尿液总排泄率均明显比粪便总排泄率大,具有显著性差异(p<0.05)。3.2.2粪便与尿液浓度分布特征与白术组相比,麻黄-白术组白术内酯在粪便中分布浓度增加,在尿液中分布浓度减少；6-8h为白术内酯经粪便排泄的高峰期,4-6h为白术内酯经尿液排泄的高峰期；36h后麻黄生物碱在粪便中低于检测限。两组白术内酯的在尿液中的分布浓度均明显比在粪便中的分布浓度大。结论1.血浆药动学：药-时曲线结果表明,麻黄与白术配伍后,NME、NMP、E在血浆中均存在二次吸收现象,且E更明显。白术与麻黄配伍后,白术内酯在血浆中存在二次吸收现象。药动学参数结果提示,麻黄与白术配伍后,麻黄生物碱在血浆中的浓度降低,白术能减少麻黄生物碱在体内的蓄积,延长麻黄生物碱在体内的作用时间,增加麻黄生物碱在体内的生物利用度。白术与麻黄配伍后,白术内酯在血浆中含量有所下降,麻黄能迟长白术内酯的达峰时间,增加白术内酯在体内的分布,延长白术内酯在体内的作用时间。结果表明二药配伍后,白术能增加麻黄生物碱在体内的疗效,降低麻黄生物碱在体内的毒性；麻黄能增加白术内酯在体内的疗效。2.组织分布：组织分布结果表明,麻黄生物碱在肺脏分布较多,与麻黄归肺经理论相一致性。麻黄与白术配伍后,麻黄生物碱在效应器官心、肺内分布增加,在消除器官肝、脾、肾内分布减少；白术能增加麻黄生物碱在肺脏与脾脏的分布。推测二药配伍后,白术能增强麻黄生物碱的疗效,与“麻黄加术汤”入肺而发汗解表,入脾则健脾散寒祛湿的功效相符。白术内酯在脾脏、肺脏分布较多,与白术归脾经理论相对应。白术与麻黄配伍后,AO-Ⅰ在效应器官肺、脑内分布增加,在消除器官肝、脾、肾内分布减少；麻黄能增加白术内酯在肺脏的分布,表明二药配伍后,麻黄能增强白术内酯的疗效。白术配伍麻黄后,AO-Ⅰ与AO-Ⅱ可通过血脑屏障,猜测AO-Ⅰ与AO-Ⅱ很可能与麻黄生物碱结合生成某种易于通过血脑屏障的物质,进入血脑屏障后又解离为AO-Ⅰ与AO-Ⅱ。3.排泄研究：排泄物研究的结果表明,麻黄生物碱与白术内酯均主要经尿液排泄。麻黄配伍白术后,白术能增加麻黄生物碱的排泄,减少麻黄生物碱在体内的蓄积；白术配伍麻黄后,麻黄能减少白术内酯的排泄,延长白术内酯在体内的作用时间。推断二药配伍后,白术能降低麻黄生物碱在体内的毒性,麻黄能增加白术内酯在体内的疗效。