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研究背景: 胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,胃癌的病因主要有遗传因素、不良生活与饮食习惯及幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)感染等因素。近年来研究发现约有10%的胃癌组织中可检测到EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV),这类胃癌被称为EB病毒相关胃癌(Epstein-BarrVirus-associatedgastriccarcinoma,EBVaGC)。EBV属DNA疱疹病毒,可通过与B淋巴细胞表面的受体分子CD21结合,使受感染的B淋巴细胞永生化,从而参与Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等恶性肿瘤的发生。但胃癌上皮细胞表面缺乏CD21分子的表达,因此,EBV参与EBVaGC发生发展的机制仍需进一步研究。 目前越来越多的证据表明EBVaGC发生可能与DNA异常甲基化相关。DNA甲基化是一种重要的表观遗传学机制,抑癌基因发生高甲基化后出现表达下调或失活从而导致肿瘤发生发展。研究发现EBVaGC组织中存在多种肿瘤相关基因高甲基化,如GSTP1、MGMT、RASSF1A、PTEN、GSTP1、P73等在EBVaGC的甲基化频率显著高于EBV阴性胃癌,因此推测EBV感染诱导宿主基因发生甲基化从而促进肿瘤发生。前期研究发现REC8在EBV感染的胃癌细胞株中表达下调,且基因启动子区表现为高甲基化,因此推断EBV诱导宿主REC8发生高甲基化使其表达下调从而参与EBVaGC的发生发展。 REC8位于染色体14q12,是减数分裂重组蛋白,在姐妹染色单体和同源染色体的分离过程中发挥关键作用。研究发现在恶性胃肠道间质瘤(GastrointestinalStromalTumors,GIST)中,REC8发生甲基化,且有REC8甲基化的患者预后较差。但REC8在EBVaGC中的功能与作用机制尚未见报道,REC8在EBVaGC中的表达及REC8的生物学功能有待进一步研究。 研究目的: 本实验拟研究REC8在EBVaGC中的表达及其与EBV感染的关系,并初步探索REC8的生物学功能以揭示其抑癌作用的机制。 研究方法: 1、收集胃癌组织标本,首先以EBER原位杂交法检测其EBV感染率,并根据EBV感染强弱将其分为EBV阴性组(EBVnGC)、弱阳性组(loEBVaGC)及强阳性组(hiEBVaGC),免疫组化法半定量检测REC8蛋白表达水平,探索EBV感染与REC8表达之间的关系。 2、提取胃癌组织DNA,亚硫酸盐修饰后进行甲基化测序,探究EBV感染与REC8甲基化水平的关系,从而揭示REC8启动子区的甲基化水平与EBV感染的相关性。 3、培养胃癌细胞BGC823、MGC803,分别转染REC8质粒及pcDNA3.1对照质粒,从mRNA及蛋白水平验证其过表达效果,通过MTT实验、细胞周期及细胞凋亡实验探索REC8生物学功能,阐述REC8在EBVaGC抑癌作用的机制。 结果: 1、154份胃癌标本中有17份EBV检测阳性,EBV感染率为11%,其中EBV强阳性组有6例,EBV弱阳性组有11例。 2、免疫组化法发现阴性组、弱阳性组、强阳性组中REC8表达水平积分分别为9.25±0.75、6.55±1.155以及2.67±0.7149,三组间REC8表达水平差异具有统计学意义(F=12.357,P=0.002)。 3、阴性组、弱阳性组与强阳性组甲基化水平分别为61.23±6.8698%,59.14±4.6468%与61.77±7.2734%,三组间甲基化水平差异无统计学意义(F=3.061,P=0.06)。 4、转染REC8质粒后,BGC823、MGC803细胞的REC8mRNA表达水平与蛋白水平均显著升高。 5、转染72h后,BGC823/REC8细胞与对照组OD值(A490nm)分别为0.711±0.0806与1.331±0.1996,MGC803/REC8细胞与MGC803/pcDNA3.1的OD值(A490nm)分别为0.758±0.0914与1.266±0.0295,差异具有统计学意义(P=0.006)。与对照组相比,转染REC8质粒对BGC823、MGC803细胞的增殖抑制率分别为46.557±6.0569%与40.153±7.2156%,差异具有统计学意义(P<0.05)。 6、BGC823/REC8细胞的G0/G1期比例较对照组相对增加(60.97±0.7454%vs47.08±0.4034%,P<0.0001),MGC803/REC8细胞的G0/G1期比例为47.34±1.238%,与对照组相比增高(40.23±1.419%),差异具有统计学意义(P<0.05),表明REC8可调节细胞周期,使胃癌细胞阻滞在G0/G1期。 7、BGC823/REC8细胞的早期凋亡细胞数较对照组增加(7.707±0.4248%vs1.477±0.3719%,P=0.0004),MGC803/REC8早期凋亡细胞数量比对照组高(15.63±1.783%,7.980±1.210%,P<0.05),表明REC8具有促进胃癌细胞早期凋亡的功能。 结论: 1、REC8可抑制细胞增殖能力、阻止细胞进入细胞周期并诱导早期凋亡从而抑制胃癌发生发展,REC8是潜在的抑癌基因。 2、EBV感染通过诱导REC8表达下调使其抑癌作用减弱从而促进胃癌发生发展。