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N-糖基化是真核生物蛋白质最重要的翻译后修饰之一，参与诸多生物过程，如蛋白的折叠、转运和分泌。近年来，N-糖基化已经作为调控蛋白质结构和功能的一种手段，得到广泛的研究。本实验室先前从草菇中克隆到一个乙酰木聚糖酯酶（AXE1），该酶包含一个酯酶家族1（CE1）的催化域和一个家族1的多糖结合域（CBM）。前期研究发现AXE1在毕赤酵母中表达时发生了过度N-糖基化，在SDS-PAGE上呈现66kDa和48kDa两个条带，且该AXE1的CBM只能吸附纤维素没有木聚糖吸附能力。本研究旨在揭示N-糖基化对AXE1在毕赤酵母中分泌、活力以及稳定性的作用，并在此基础上通过糖基化工程和CBM替换来改善AXE1的性能。具体研究内容和结果如下：本实验通过添加不同浓度衣霉素来研究糖基化对蛋白分泌的影响，结果显示AXE1的分泌水平随着衣霉素浓度的增加而降低，衣霉素终浓度为10μg/mL时，AXE1的分泌量下降了58%，且AXE1的N-糖基化受到明显的抑制。因此，结果表明了N-糖基化对于AXE1的分泌有着重要的作用。本实验进一步研究了N-糖基化对AXE1活力及稳定性影响。比较了经衣霉素和EndoH去糖基化的两种AXE1和未处理的AXE1在温度耐受力、pH耐受力、尿素抗性以及蛋白酶抗性方面的差别，结果显示N-糖基化对AXE1的催化活力没有影响，而在维持稳定性方面有一定的作用。AXE1存在两个N-糖基化位点，分别位于N31和N99上。本实验通过定点突变分别去掉这两个N-糖基化，构建了31号N-糖基化缺失突变体（T33A、T33N、T33S）和99号N-糖基化缺失突变体（N99A、N99Q、T101A）来研究这两个N-糖基化各自的作用。结果显示，这两个位点上的突变体与原酶相比，在比活力上没有明显差别，而稳定性均有明显的下降。在分泌水平方面，突变体均有不同程度的下降，其中31号N-糖基化缺失突变体比AXE1下降了26%-50%，99号N-糖基化缺失突变体下降了18%-23%。通过在AXE1的N端24号位和34号位分别增加一个N-糖基化位点，构建突变体Q24N和G36T。与AXE1相比，Q24N的分泌水平提高了5%，但是稳定性有所下降；G36T的热稳定性有所提高，但分泌水平下降了36%；两者的比活力均没有明显变化。在N31A的N端相同位置也分别增加一个N-糖基化位点，构建了突变体N31AG36T和Q24NN31A。N31AG36T的分泌水平较N31A提高了8倍，催化活力提高30%。而Q24NN31A的分泌和活力与N31A相比均没有明显的变化。本实验还利用人工构建的木聚糖吸附域CBM2b-2和CBM6分别替换了AXE1原有的CBM1，构建了两个杂合酶AXE1CD-CBM2b-2和AXE1CD-CBM6。这两个杂合酶较AXE1对木聚糖的吸附能力有所提高，对不溶性底物乙酰木聚糖的活力均提高20%左右。