胃癌是世界第4大常见肿瘤。尽管近半世纪以来全球胃癌发病率有所下降，但在中国的发病却率逐年上升。胃癌的分类可分为早期胃癌及进行性胃癌，临床表现症状则是模糊且不具特异性。大部份诊断出胃癌的病人被发现时都已经是进行性疾病来呈现。统计发现超过50％的病人会进行手术，但是手术之后，大约60-70％的病人发生转移。转移性的胃癌仍然是一种无法治愈的疾病。一般而言，胃癌病人平均五年的存活率大约22％左右，而晚期胃癌患者的五年的存活率更小于5％以下。化学疗法已经成为胃癌治疗不可缺少的方法之一，缓和的化学疗法已经被证明能提高存活率或末期生活品质。近年来科研人员一直在努力深入理解胃癌的生物学特性，以期提高早期诊断、预后和最终治愈，然而由于缺乏统一标准的化疗、放疗和手术切除，晚期胃癌患者的治疗结果很不理想。因此，阐明胃癌的发病机制，争取早期诊断，寻求有效的治疗手段是亟待解决的重要课题。胃癌的发展是受多种因素影响，许多致癌基因和肿瘤抑制基因参与其中，而最主要的是遗传学及表观学的异常。其中癌基因的激活与抑癌基因的失活是其重要的遗传学基础。相对于因功能获得性变异而导致的癌基因激活，抑癌基因的失活源自功能失去性变异，提高了肿瘤易感性，在肿瘤的发生、发展过程中起着更大的最用。鉴定参与胃癌形成的新基因，对这些基因的生物学性质进行研究，将有助于我们开发早期诊断方法，进行靶向治疗。　　 本研究课题以与胃腺癌相关的候选抑癌基因BIN1为研究对象，检测了它们在胃腺癌中的表达情况，并初步探讨了关于预后方面的可能因素。　　 Bridging integrator1(BIN1)是由染色体2q14-2q21上长度达59258 bps的DNA片段中的16个外显子编码，是新鉴定的有肿瘤抑制基因特征的人类基因产物。BIN1最初是由于它可干涉并抑制cMyc诱导的癌变而被鉴定的。Sakamuro等发现在人乳腺癌细胞株MCF7和乳腺癌组织中存在BIN1的缺失。另一些研究发现BIN1基因在乳腺癌、前列腺癌和恶性黑素瘤中表达下调或失活，其异位再表达与细胞程序化死亡过程有关。Kai等发现BIN1的缺失与乳腺癌进展有关。此外，在小鼠模型中敲除BIN1基因18-20个月后，50％的小鼠自发产生肺癌，10％的小鼠产生肝癌。上述结果提示BIN1可能具有肿瘤抑制基因的功能。本研究诣在检测BIN1在胃腺癌中的表达情况，分析其与临床病理参数及预后的关系，探讨其在危险中发挥的作用机制。　　 材料与方法:　　 患者肿瘤组织样本　　 经南方医院伦理委员会批准和签署知情同意书后，从2003年到2006年之间在南方医院接受手术的胃腺癌患者中，获得234份石蜡包埋的胃腺癌样本。所有的患者均未接受术前治疗。患者包括157位男性和77位女性，平均年龄58岁（年龄范围为17-84岁）。所有的组织块均切割成4μm厚连续切片。组织学分型按照世界卫生组织的分类标准进行。从2005年到2007年之间在南方医院接受手术切除的胃腺癌患者中，获得另外共计51份新鲜肿瘤组织和相邻的非肿瘤组织样本。患者均未接受任何术前治疗。患者包括32位男性和19位女性，平均年龄50岁（年龄范围为21-76岁）。所获得的组织样本立即浸入RNAlater(Ambion Inc.，USA)，保存于-80℃。所有的患者均按照第7版国际抗癌联盟(UICC)的肿瘤、淋巴结及远处转移(TNM)分期系统进行分期。　　 荧光定量PCR(RT-qPCR)　　 按照厂商说明，使用TRIzol溶液（美国Invitrogen公司）从约150mg原发性肿瘤中提取总RNA。使用无RNase的DNase消除DNA污染。用NANO DROP分光光度计(ND-1000型，美国Thermo Scientific公司)在260 nm测得光密度值，计算总RNA浓度。根据厂商的建议，使用2μg总RNA和M-MLV反转录酶（美国Promega公司）反转录(RT)合成第一条链cDNA。所产生的cDNA进行荧光定量PCR，对GAPDH（内参基因）和BIN1的相对表达水平进行评估。相应的引物对:BIN1sense:5-ACAACGACCTGCTGTGGATGG-3;BIN1 antisense:5-CGTGACTTGATGTCGGGGAACT-3;GAPDHsense:5-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3;GAPDHantisense:5-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3。使用Roche LightCycler(@)480荧光定量PCR仪进行基因特异性扩增。15μl PCR反应混合物包括:0.5μl按上述方法合成的cDNA，7.5μl2×SYBR Green主混合液（美国Invitrogen公司）以及每对寡核苷酸引物200 nM。扩增反应条件为:在95oC变性10分钟，95oC30秒和60oC退火60秒，共45个循环。每个样本检测两次，每个实验使用从不同反转录得到cDNA，至少重复两次。通过比较2-ΔΔCt值进行相对定量分析。　　 免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)分析　　 从石蜡包埋的胃腺癌组织块切割厚度为4μm的组织切片。切片脱石蜡，用乙醇梯度再水化。对于抗原修复，切片在Target Retrieval Solution(Dako)中于99-100℃蒸20分钟。用phosphate buffered solution(PBS)冲洗后，用3％ H2O2在室温下进行蛋白质封闭20分钟。组织切片与BIN1一抗(美国Santa Cruz)（1∶200稀释）在4oC孵育过夜。用PBS洗涤3次后，切片与生物素化的二抗(DAKO)在室温下孵育30分钟。最后用3，3二氨基联苯胺四盐酸(DAB，DAKO)显影可视信号，所有的切片都用苏木精复染。　　 IHC染色结果的半定量分析如下:阴性-0:肿瘤细胞无染色;弱阳性-1∶10％肿瘤细胞阳性;中度阳性-2∶11％到50％肿瘤细胞阳性;强阳性-3∶50％以上肿瘤细胞阳性。BIN1免疫染色得分范围从0到9。我们对BIN1表达水平定义如下:‘-’(得分0-1);‘+’(得分2-3);‘++’(得分4-6);‘+++’（得分＞6）。在本研究中，‘-’代表阴性表达，‘+’，‘++’和‘+++’属于阳性表达。　　 蛋白质印迹分析　　 在RIPA裂解缓冲液中使胃腺癌组织和非肿瘤组织裂解。在12％ SDS PAGE胶中分离30μg蛋白质样品，之后转移到PVDF膜上。用5％脱脂牛奶封闭非特异性结合位点1小时后，用BIN1多克隆一抗（1∶2000稀释，美国Proteintech公司）在4 oC孵育过夜。用TBST洗涤膜三次之后，用适当的二抗与膜在室温下孵育1小时。然后使用增强型化学发光系统(ECL，美国Pierce公司)进行膜检测。　　 统计分析　　 所有的统计分析使用SPSS17.0软件（美国芝加哥SPSS公司）。成对样本t-test用于比较在肿瘤组织样本和相邻非肿瘤组织样本中的BIN1 mRNA水平。使用x2检验和Pearson相关系数分析BIN1表达和各种临床病理学特征之间的相关性。使用Kaplan-Meier方法计算存活曲线并通过时序检验进行比较。对于单因素和多因素分析，使用Cox比例风险模型研究临床病理学变化和BIN1表达对存活的影响。双侧检验的P值＜0.05可认为有统计学意义。　　 结果:　　 1)使用RT-qPCR对51对胃癌肿瘤组织和相邻非肿瘤组织的BIN1转录水平进行了研究。与在相邻非肿瘤组织中的BIN1 mRNA水平相比较，在40个(78.4％)肿瘤组织样本中BIN1 mRNA水平显著降低(P=0.0015)。　　 2)用免疫组化方法检测经组织病理学证实的胃腺癌组织切片(n=234)。BIN1在肿瘤组织和相邻的非肿瘤组织中的表达水平有所不同。在234位胃癌患者中，有106位(45.3％)患者的BIN1表达水平较高，有128位(54.7％)患者的BIN1表达水平较低。在低分化的胃癌患者中(G3)，BIN1的表达显著下降(P＜0.001)。在深度侵袭(T4)(P＜0.001)和淋巴结转移(N）(P＜0.001)的肿瘤中可较多地观察到BIN1表达下降。另外，144位Ⅲ期和Ⅳ期患者中有92位(63.9％)的BIN1表达水平较低(P＜0.001)。使用单因素和多因素分析，比较了BIN1表达和其他临床病理学参数对胃癌患者预后的影响。单因素分析表明有6个因素对总存活率的影响有统计学意义，包括肿瘤大小(P＜0.001)，根治切除(P＜0.001)，BIN1表达(P＜0.001)，以及T期(肿瘤侵袭深度，P＜0.001)，N期(淋巴结转移，P＜0.001)和M期(转移，P＜0.001)，根据第7版UICC TNM分类进行分期。其后的多因素分析结果表明，肿瘤大小(P＜0.031)，BIN1表达(P＜0.009)，T期(肿瘤侵袭深度，P＜0.018)和N期(淋巴结转移，P＜0.004)是胃腺癌患者总存活率的独立影响因子。BIN1低表达患者的相对死亡风险高于BIN1高表达患者0.552倍(HR=0.552，95％CI=0.354-0.862)。　　 3)使用Kaplan-Meier存活曲线和时序检验(log-rank test)评估BIN1对胃腺癌患者总成活率的预后影响。结果证实BIN1低表达患者的预后明显比BIN1高表达患者差[72.6 vs.43.9％（总存活率）和72.6 vs.53.1％（5年存活率），P＜0.001]。　　 4)通过蛋白质印迹检测了胃癌患者的BIN1蛋白水平。与在相邻非肿瘤组织中的BIN1蛋白水平相比较，在51个肿瘤组织样本中有33个(64.7％)样本的BIN1蛋白表达水平下降(P=0.012)。　　 结论:　　 本研究使用大量临床样本，通过RT-qPCR，免疫组织化学，Western Blot的试验方法。证实在胃腺癌患者中BIN1的表达下调。并且BIN1表达的下降与预后不良相关。结合本研究结果与Kristin等人的结果，我们进一步证实BIN1可作为潜在的肿瘤抑制基因和胃癌的预后标志物以及作为胃癌治疗的新潜在靶标。