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表观遗传学是指在基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达或表型发生可遗传改变的现象。甲基化是DNA的一种化学修饰,是一种相对稳定和可遗传的表观遗传标记,对许多生物过程至关重要。在生物体内DNA甲基化和去甲基化的动态平衡控制着基因表达强度。DME(DEMETER)是DNA去甲基化所需的一种糖基酶,在拟南芥中dme突变体使胚乳中的DNA甲基化升高,并且影响胚乳的发育。在苜蓿中dme突变后会影响根瘤的发育。但大豆中DME蛋白的具体功能尚不清楚。因此在本研究中,以大豆为试验材料,利用CRISPR/Cas9技术构建了 GmDME突变体,并对突变体进行甲基化分析和表型观察,以进一步解析DME的功能。本研究主要结论如下:1、生物信息学分析显示,在大豆基因中存在两个较高相似度的拷贝,GmDMEa(Glyma.20G1 88300)和GmDMEb(Glyma.10G202200),都具有 ENDO3c 结构域和RRM_DME结构域。GmDMEa基因CDS区全长5553bp编码1850个氨基酸,GmDMEb基因CDS区全长4290bp编码1429个氨基酸。DME在植物界是比较保守的,系统进化树分析可知,GmDME蛋白与同为豆科的苜蓿DME蛋白的亲缘关系最近。2、以大豆东农50为实验材料,经RT-PCR显示,DME基因在大豆中的表达具有组织特异性,GmDMEa和GmDMEb均在干种子中表达量最高。3、利用CRISPR/Cas9技术成功构建敲除载体,经遗传转化鉴定得到7种纯合突变体共88株,其中5种为碱基缺失型突变,2种为碱基插入型突变。5种突变体导致移码突变和提前终止翻译。4、田间表型观察:经过比较发现,相比于野生型,突变体植株的株高、分支数、荚数、蛋白含量和油脂含量无明显变化;突变体植株的开花数增加了 56%,种子百粒重增加范围从16.9%到38%;Gmdmeb-2C和Gmdmeb-3C类型突变体植株四粒荚数的百分比分别增加了 37%和 35.8%;Gmdmeb-1C、Gmdmeb-3C、Gmdmeb-5C、Gmdmeb-7C类型突变体植株单株产量分别增加了 37%、29.1%、38%、21%,并且与野生型之间存在显著差异。Gmdme突变体影响了大豆种子的发育,导致大豆种子的百粒重增加。5、经甲基化分析,大豆Gmdme突变体影响了转座子区DNA甲基化水平,并在CHH位点的甲基化水平显著提高。