目的：用多组分反应(MCRs)合成四氢嘧啶类化合物PL-1215,并探讨其镇痛活性及其作用机制。方法：(1)四氢嘧啶类化合物PL-1215的合成：以丁炔二乙酸二甲酯、甲醛、环戊胺为原料,冰醋酸为催化剂,乙醇为溶剂,采用多组分反应法合成四氢嘧啶类化合物PL-1215,以薄层色谱法(TLC)检测反应的进度,通过重结晶或柱层析法对粗产物进行分离纯化。通过质谱(MS)、碳谱(13C-NMR)和核磁共振氢谱(1H-NMR)分析确认PL-1215的结构。(2)四氢嘧啶类化合物PL-1215的镇痛活性研究：1)通过小鼠醋酸扭体实验,观察PL-1215的镇痛作用：取BALB/c小鼠50只,均分为5组,分别为溶媒对照组(0.1%CMC-Na:20ml/kg, i.g.),曲马多阳性对照组(10mg/kg, i.g.)及PL-1215高中低剂量组(90mg/kg,30mg/kg,10mg/kg, i.g.),给药后1h,按0.1ml/10g.b.w腹腔注射给以新配的0.7%醋酸生理盐水液。观察并记录给以醋酸刺激后小鼠20min内的扭体次数。2)通过福尔马林致痛实验,观察PL-1215的镇痛作用：取SD大鼠40只,均分为5组,分别为模型组(0.1%CMC-Na:20ml/kg, i.g.),曲马多阳性对照组(10mg/kg,i.g.)及PL-1215高中低剂量组(90mg/kg,30mg/kg,10mg/kg, i.g.),给药后30min,于各组大鼠右后足背皮下分别注射50μl2%福尔马林溶液。观察并记录0-5min及15-30min内大鼠舔、咬右后足的时间。3)通过热板法实验,观察PL-1215的镇痛作用：取BALB/c小鼠50只,均分为5组,分别为溶媒对照组(0.1%CMC-Na:20ml/kg, i.g.),曲马多阳性对照组(10mg/kg,i.g.)及PL-1215高中低剂量组(90mg/kg,30mg/kg,10mg/kg, i.g.),于给药前并于给药后0.5h测定痛阈,以小鼠足部接触热板到开始舔后足的时间为痛阈(s),以连续测3次(每次间隔5min)舔足潜伏期的平均值为痛阈。4)通过大鼠光照甩尾实验,观察PL-1215的镇痛作用：取SD大鼠40只,均分为5组,分别为溶媒对照组(0.1%CMC-Na:20ml/kg,i.g.),曲马多阳性对照组(10mg/kg, i.g.)及PL-1215高中低剂量组(90mg/kg,30mg/kg,10mg/kg, i.g.),用聚光灯照射大鼠尾部皮肤致痛,甩尾潜伏期为由辐射开始到鼠尾摆动的时间,单位为秒(s)。以连续测3次(每次间隔5min)甩尾潜伏期的平均值为痛阈。于给药前30min及给药后30min测定大鼠痛阈。5)以醋酸扭体实验为模型,通过测定小鼠脊髓c-fos蛋白及c-fos mRNA的表达,观察PL-1215的镇痛作用：取BALB/c小鼠24只,均分为4组,分别为溶媒对照组(0.1%CMC-Na:20ml/kg,i.g.),模型组(0.1%CMC-Na:20ml/kg, i.g.),曲马多阳性对照组(10mg/kg,i.g.)及PL-1215组(30mg/kg, i.g.),给药1h后,按O.lml/lOg.b.w腹腔注射给以新配的0.7%醋酸生理盐水液进行刺激(后3组),20min后,小鼠颈椎脱臼处死,取脊髓,用western blot测定小鼠脊髓c-fos的表达,用实时定量PCR(qPCR)测定小鼠脊髓c-fos mRNA的表达,记录实验结果。(3)四氢嘧啶类化合物PL-1215的镇痛机制研究：1)以醋酸扭体实验为模型,将60只小鼠均分为两大组,两大组又各分为3小组,每组10只,分别灌胃给以0.5%CMC-Na,PL-1215(30mg/kg),灌胃给以曲马多(10mg/kg)作为阳性对照组,一大组于给药前15min皮下注射给以纳诺酮,而另一组则不给以纳洛酮处理,观察纳洛酮对PL-1215镇痛作用的影响。2)以醋酸扭体实验为模型,将60只小鼠均分为两大组,两大组又各分为3小组,每组10只,分别灌胃给以0.5%CMC-Na、PL-1215(30mg/kg)、L-NAME (37.5mg/kg),一大组于给药前20min灌胃给以L-Arg(100mg/kg),而另一组则不以L-Arg处理,观察NO对PL-1215镇痛作用的影响。3)以醋酸扭体实验为模型,将50只小鼠均分为5组,不同组分别给以CaCl2(30mg/kg,i.p.),EGTA(70mg/kg,i.p.), PL-1215(30mg/kg,i.g.),PL-1215+CaCl2(30mg/kg,i.p.), PL-1215+EGTA(70mg/kg,i.p.),观察Ca2+对PL-1215镇痛作用的影响。4)以醋酸扭体实验为模型,将60只小鼠均分为两大组,两大组又各分为3小组,每组10只,分别灌胃给0.1%CMC-Na、PL-1215(30mg/kg),腹腔注射给以氯丙咪嗪(10mg/kg),一组于给药24h前腹腔注射给以利血平(5mg/kg),而另一组则不以利血平处理,观察PL-1215对体内不同部位单胺类递质的影响。5)以醋酸扭体实验为模型,将30只小鼠均分为3组,正常组、模型组及实验组,分别灌胃给以0.5%CMC-Na(前两组),PL-1215(30mg/kg),通过荧光分光光度法测定比较不同组小鼠脑干中的单胺类递质NA、DA、5-HT的含量,从而推断PL-1215是否通过影响血液或脑干中的单胺类递质而发挥镇痛作用,同时提示PL-1215可能的作用部位,然后采用实时定量PCR测定PL-1215对醋酸致痛20min后脑干中TPH mRNA、TH mRNA表达的影响,更深入地揭示其可能的作用机制。(4)四氢嘧啶类化合物PL-1215的成瘾性研究：连续灌胃小鼠待试药物35天,每天1次,末次给药后2h,先称体重,然后腹腔注射纳络酮(5mg/kg),将小鼠放入直经为30cm的圆桶内,观察10分钟内小鼠跳跃和直立行为的次数；30分钟时,再称体重一次。跳跃、直立行为的次数越多以及体重下降越明显提示成瘾性越强。(5)四氢嘧啶类化合物PL-1215的急性毒性研究：采用健康小鼠,体重20.0±2.0g,雌雄各30只,随机分成六组,每组雌雄各占5只,经口灌胃一次性给以PL-1215,剂量分别为6000、5390、4840、4340、3900、3500mg/kg,记录小鼠毒性反应情况和死亡动物分布,以Bliss统计法测定LD50值。结果：(1)反应经2h完成,反应产物为淡黄色液体,浓缩后,可通过柱层析法(流动相：石油醚：乙酸乙酯=10：1-2：1)分离提纯得到目标产物,亦可放入4℃冰箱通过重结晶获得目标产物,目标产物(PL-1215)为白色固体,产物经质谱(MS)、碳谱(13C-NMR)和核磁共振氢谱(1H-NMR)分析确认(化学名：1,3-二环戊基-1,2,3,6-四氢嘧啶-4,5-二甲酸二甲酯)。反应条件为,各组分物质的量之比：丁炔二酸二甲酯：环戊胺：甲醛：乙酸=1：2：3：2；溶剂：乙醇；投料方式：先加环戊胺和丁炔二酸二甲酯于乙醇中预反应30min,再加入环戊胺、甲醇、乙酸的混合液反应1.5h；反应温度：室温。在该反应体系下,产率为79.5%。(2)醋酸扭体实验中,PL-1215高中低剂量组及阳性对照组均能明显减少小鼠的扭体次数,与模型组相比有显著性差异；福尔马林致痛实验中,PL-1215高中低剂量组及阳性组能减少第一阶段和第二阶段大鼠添或咬脚的时间,对第一阶段的作用更为明显；热板实验中,PL-1215高中剂量及阳性组能明显抑制由高温刺激所引起的痛觉反应,与模型组相比有显著性差异；光照甩尾实验中,PL-1215高中低剂量及阳性组能明显抑制由辐射热伤害所引起的大鼠痛觉反应,与模型组相比有显著性差异。醋酸组c-fos和c-fos mRNA表达量显著增多,与正常组相比有显著性差异,PL-1215组和阳性组c-fos和c-fos mRNA表达量明显减低,与醋酸组相比有显著性差异。(3)四氢嘧啶类化合物PL-1215可能的镇痛机制：1)经比较,纳洛酮能显著降低曲马多的镇痛作用,但对PL-1215的镇痛作用没有明显阻断作用。2)经比较,L-Arg能显著降低L-NAME的镇痛作用,但对PL-1215的镇痛作用没有明显影响。3)经比较,CaCl2, EGTA对PL-1215的镇痛作用均无明显影响。4)经比较,利血平不仅能显著降低氯丙咪嗪的镇痛作用,也能明显降低PL-1215的镇痛作用。5)通过测定表明,PL-1215能显著提高醋酸处理后小鼠脑干中5-HT的量,但对DA仅有微弱的影响,对NA基本没有影响。实时定量PCR测定表明,PL-1215能显著提高醋酸处理后小鼠脑干中TPH mRNA,TH mRNA的表达,与醋酸组相比有显著性差异。(4)经长期给药后,曲马多组体重明显减轻,跳跃、直立行为次数明显增多,和模型组相比有显著性差异,而PL-1215组体重无明显减轻,跳跃、直立行为次数亦无明显增多,和模型组相比无显著性差异。(5)通过测定,小鼠灌胃LD5o为4849mg/kg,95%可信区间为4323-5439mg/kg;是中等有效剂量的100多倍。结论：(1)以丁炔二酸二甲酯、环戊胺和甲醛为原料,乙酸为催化剂,乙醇为溶剂,通过多组分反应(MCRs),经氢氨化、aza-ene类型反应、亲核加成、以及脱水环化等一系列多米诺反应合成四氢嘧啶类化合物PL-1215,目标产物可经硅胶柱层析(流动相：石油醚：乙酸乙酯=10：1～2：1)或结晶法分离纯化获得,所得产物为白色固体。该法具有操作简单、产率高、反应条件温和、对环境友好等优点。(2)PL-1215能显著减少醋酸扭体实验中小鼠的扭体次数,提示其可能具有抗炎镇痛作用；PL-1215能显著的减少福尔马林实验中第一阶段大鼠添、咬脚时间,而对第二阶段的影响弱于第一阶段,提示镇痛作用可能为中枢镇痛；PL-1215能显著抑制由热板刺激所引起的小鼠痛觉反应及由辐射热伤害所引起的大鼠痛觉反应,进一步提示其镇痛作用可能为中枢镇痛。PL-1215能显著减少醋酸刺激小鼠c-fos及c-fos mRNA的表达,从分子角度提示其镇痛作用。(3)四氢嘧啶类化合物PL-1215可能的镇痛机制：1)纳洛酮对PL-1215的镇痛作用基本无阻断作用,提示PL-1215不是通过激动阿片受体而发挥镇痛作用的。2) L-Arg对PL-1215的镇痛作用无明显影响,提示PL-1215不是通过NO-cGMP-ATP通路发挥作用的。3) CaCl2, EGTA对PL-1215的镇痛作用均无明显影响,提示PL-1215亦不是通过Ca2+而发挥镇痛作用的。4)利血平能显著降低PL-1215的镇痛作用,提示PL-1215可能是通过影响体内单胺类递质的水平而发挥镇痛作用的。5)PL-1215能显著提高醋酸处理后小鼠脑干中5-HT的量,对DA有一定影响,对NA基本没有影响,提示PL-1215可能是通过提高脑干5-HT、DA的表达而发挥镇痛作用的；PL-1215能显著提高醋酸处理后小鼠脑干中TPHmRNA的表达,提示PL-1215可能是通过影响5-HT合成酶,进而影响5-HT的合成而发挥镇痛作用的。(4)经长期给药后,曲马多组出现了弱的成瘾性,说明模型可靠,而PL-1215组未出现明显的戒断症状,提示其成瘾性极低。(5)经测定,小鼠灌胃LDso为4849mg/k,95%可信区间为4323～5439mg/kg;是中等有效剂量的100多倍,提示PL-1215毒性低,安全性好。