论文部分内容阅读
目的:成釉细胞瘤（ameloblastoma,AB）作为口腔颌面部最常见的牙源性肿瘤之一,虽然生长缓慢,但其生长易侵袭术后易复发等特点使其一直为学者研究的重点及难点,现阶段对与AB的治疗方法主要以手术切除为主,这种治疗方式降低术后复发率的同时会造成颌面部的缺损,因此亟待效果更显著,副作用更小的治疗方法。程序性死亡受体配体1（Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1）是程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD1）的配体之一,PD1与PD-L1结合后,正常的T细胞相关激活及转导通路被抑制,这对于保持机体免疫功能稳定至关重要,肿瘤则借助PD-L1相关通路逃避机体的免疫监视,从而介导相关不良生物学行为;因其在AB中报道较少,因此研究其在AB中的表达及意义是可行的。微小RNA（Micro RNA,miRNA）广泛存在于机体中,其表达对于控制机体生长发育异常重要,异常表达可直接或间接影响疾病发生发展。目前,关于miRNA的研究已经延伸到诊断及治疗领域,同时,已不断有相关药物开始进行临床试验及应用于肿瘤治疗,显现出较好的疗效,本课题组经过前期筛选决定选取hsa-miR-224-3p作为可能的上游,进而验证其与PD-L1之间的关系,以探究其与AB发生发展的关系。研究方法:（1）应用课题组前期Human mRNA芯片进行下游基因筛选。（2）应用实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR,q RT-PCR）技术,免疫蛋白印迹（Western Blot,WB）技术检测AB组织及正常口腔黏膜（Normal oral mucosa,NOM）组织中PD1/PD-L1表达并进行统计检验。（3）应用免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC）检测AB存档蜡块及NOM组织蜡块中PD1/PD-L1表达水平并结合相关临床病历资料进行统计分析。（4）应用公共数据库进行PD-L1上游基因预测,选择hsa-miR-224-3p作为下步实验对象。（5）应用q RT-PCR技术检测AB及NOM中hsa-miR-224-3p的表达水平。（6）应用双荧光素酶验证报告实验证实hsa-miR-224-3p与PD-L1是否存在靶向调控关系。（7）将hsa-miR-224-3p的mimic及NC转染至永生化AB细胞系HAM-1,HAM-3及永生化成纤维细胞系HAM-2,验证目的基因表达水平,通过划痕及transwell实验验证转染hsa-miR-224-3p mimic是否会对肿瘤侵袭产生影响。结果:Human mRNA芯片显示AB及NOM组织中PD-L1表达差异显著（P<0.05）。（2）q RT-PCR实验结果显示,AB组织中PD-L1相对表达量上调明显,差异有统计学意义（P<0.05）,PD1表达差异不显著（P>0.05）;WB实验结果显示,PD-L1在AB组织及NOM组织中均有表达,AB组织中PD-L1表达水平明显高于NOM中PD-L1表达水平,差异有统计学意义（P<0.05）;PD1同时表达于AB及NOM,差异不明显（P>0.05）。（3）IHC结果显示,AB组织中PD-L1表达主要呈阳性,NOM组织中PD-L1表达主要呈阴性表达,差异有统计学意义（P<0.05）,临床资料统计结果显示,成釉细胞瘤中PD-L1的表达差异在性别、年龄、病理分型及复发情况方面均不明显,无统计学意义（P>0.05）;相较于其他部位,发生于下颌的成釉细胞瘤中PD-L1表达率明显高于其他部位（P<0.05）。AB组织中PD1表达差异不显著（P>0.05）。（4）结合公共生物信息学网站发现hsa-miR-224-3p可能为PD-L1的调控上游,可作进一步研究。（5）q RT-PCR结果显示,AB组织中hsa-miR-224-3p相对表达量明显降低,差异显著（P<0.05）。（6）双荧光素酶验证报告结果显示hsa-miR-224-3p与PD-L1存在结合位点,可靶向调控PD-L1。（7）q RT-PCR结果显示,转染hsa-miR-224-3p mimic后HAM-1,HAM-3的PD-L1表达下降明显（P<0.05）,HAM-2的PD-L1变化不明显（P>0.05）;WB结果显示转染mimic后HAM-1,HAM-3组PD-L1表达下降,明显低于NC转染组（P<0.05）,HAM-2未检测出有效蛋白;划痕实验结果显示HAM-1,HAM-3 mimic转染组细胞迁移率小于对照组（P<0.05）,HAM-2组差异不显著（P>0.05）,transwell显示HAM-1,HAM-3 mimic转染组细胞计数明显低于对照组,差异显著,HAM-2细胞系两组差异不明显（P>0.05）。结论:（1）AB组织中PD-L1表达明显升高,hsa-miR-224-3p表达明显降低,可以作为AB诊断的相关分子标记物（2）AB中PD-L1及hsa-miR-224-3p表达呈负相关,hsa-miR-224-3p可以靶向调控PD-L1,进而影响AB侵袭性生长。