背景:人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）属于β-疱疹病毒亚家族成员,是一种机会性致病病原体,其人群感染率在90%以上。HCMV在免疫力正常的个体中潜伏感染,而在免疫力低下患者如癌症晚期、应用免疫抑制剂的骨髓或器官移植以及HIV感染的患者,HCMV被再次激活,进入裂解复制阶段,引起全身感染病症,包括肝炎、肺炎、大肠炎以及神经系统疾病等。已有研究报道,无论是在HCMV感染的潜伏期还是激活期,肺炎都是最常见的并发症。更昔洛韦是目前治疗HCMV感染相关疾病的首选药物,但由于其长期使用具有耐药性、骨髓抑制、致癌等严重副作用而受到限制。因此迫切需要开发新的策略来治疗HCMV引起的肺炎。双硫仑（Disulfiram,DSF）是美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）认证的治疗酒精中毒的药物,具有安全、高效、毒性低的优点。近年来发现其具有一定抗炎和抗病毒的作用。据报道,DSF在多种疾病模型中具有治疗作用,包括脓毒症、痛风性关节炎以及SARS-Co V-2感染等。NLRP3炎症小体是由NLRP3蛋白、ASC、Pro-caspase-1组成的蛋白复合物,可以识别多种病原体,激活caspase-1,产生IL-1β和IL-18,并启动炎症过程。NLRP3与感染、炎症和自身免疫过程有关,在先天免疫中发挥关键作用。有研究表明,NLRP3炎症小体参与多种病毒性疾病的发生发展,包括:SARS-Co V 2感染性肺炎、HCV引发的肝炎、MCMV感染性耳炎等。而近期有研究报道,DSF可以通过抑制NLRP3炎症小体进而减轻痛风性关节炎。CMV感染具有严格的种属特异性,已有研究表明MCMV模型是研究CMV感染生物学和发病机制的重要模型,基于本课题组已构建的MCMV肺炎小鼠模型以及DSF在炎症和病毒性疾病方面的治疗潜力,本研究提出DSF可能对MCMV感染性肺炎有治疗作用,且可能参与抑制NLRP3炎症小体的激活。目的:本研究主要探究DSF对MCMV感染性肺炎作用并进一步探究其作用机制和参与的信号通路,为DSF临床治疗HCMV感染性肺炎提供理论和实验依据。方法:1、双硫仑对MCMV感染的BMDMs的作用:通过分离小鼠骨髓细胞,用M-CSF诱导其成为巨噬细胞,观察细胞贴壁形态并用流式细胞术检测巨噬细胞表面标记CD11b和F4/80的表达情况;用CCK8试剂盒和Calcein/PI试剂盒检测不同浓度DSF对巨噬细胞的活性影响;RT-PCR和ELISA法检测BMDMs中炎症细胞因子的表达;收集细胞上清进行病毒滴度检测。2、双硫仑对MCMV感染性肺炎的作用:将小鼠随机分为5组（空白对照组、MCMV感染组、50 mg/kg DSF治疗组、100 mg/kg DSF治疗组、60 mg/kg GCV阳性对照组）,分别给药预处理2天,再用2×10~5 PFU的MCMV滴鼻感染小鼠,观察并记录小鼠生存情况和体重变化;收集肺组织进行HE染色观察肺部病理变化;RT-PCR和ELISA法检测各组小鼠肺组织炎症细胞因子IL-10、TNF-α、IL-1β和MCP-1的表达;流式细胞术检测肺泡灌洗液中巨噬细胞和中性粒细胞的变化;WB和免疫荧光法检测肺组织中纤维化相关蛋白α-SMA和collagen I的表达;收集肺泡灌洗液进行病毒滴度检测。3、双硫仑减轻MCMV感染性肺炎的分子机制研究:免疫荧光法检测肺组织NLRP3和ASC的表达水平;WB检测肺组织和BMDMs中NLRP3炎症小体信号通路相关蛋白p NF-κB（pp65）、NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β的表达水平;DCFH-DA试剂盒检测BMDMs中活性氧ROS产生水平。结果:1、M-CSF诱导的细胞贴壁生长,呈短梭形,有钝圆形的突起,且CD11b+F4/80+巨噬细胞群高达89%;CCK8试剂盒和Calcein/PI试剂盒检测结果显示实验浓度DSF处理后对BMDMs活性无明显影响;此外,DSF治疗后抗炎细胞因子IL-10显著上调,而促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-1β和MCP-1）显著下调,减少MCMV病毒载量。2、DSF和阳性对照药GCV预处理MCMV感染性小鼠后,生存曲线和体重变化图显示,与MCMV感染组相比,DSF和阳性对照GCV治疗后均可以显著延长小鼠生存期和减小体重下降的幅度;HE染色结果显示MCMV感染组小鼠肺泡腔结构被破坏,免疫细胞浸润,肺泡组织增加,肺泡间隙减少。与MCMV感染组相比,DSF和GCV治疗后小鼠肺组织病变显著改善;RT-PCR和ELISA结果显示,DSF治疗后抗炎细胞因子IL-10显著上调,而促炎细胞因子（包括TNF-α、IL-1β和MCP-1）显著下调,且具有剂量依赖性;流式细胞术结果显示,DSF治疗可显著减少小鼠肺部免疫细胞的浸润;WB和免疫荧光法检测结果显示,DSF治疗可显著降低肺纤维化相关蛋白α-SMA和collagen I的表达水平;BALF的病毒滴度测定结果显示DSF治疗后MCMV病毒载量下降。3、免疫荧光结果显示,与MCMV感染组相比,DSF治疗或者GCV治疗后炎症小体相关蛋白NLRP3和ASC的表达水平显著降低;WB检测结果显示,MCMV感染后小鼠肺组织和BMDMs中p NF-κB（pp65）、NLRP3、ASC、Caspase1和IL-1β的蛋白表达水平显著上调,而DSF治疗后逆转了这一趋势;DCFH-DA试剂盒检测结果显示,DSF处理显著降低了MCMV感染诱导BMDMs中活性氧ROS的产生。以上结果均存在统计学差异（P＜0.05）。结论:1、成功分离培养出小鼠原代骨髓巨噬细胞;不同浓度DSF处理不影响BMDMs的活性,且对细胞无明显毒性作用。DSF治疗可显著降低MCMV感染BMDMs中促炎细胞因子表达水平,降低病毒载量。2、DSF治疗后通过改变先天免疫反应,降低炎症细胞在肺部的聚集,进而减轻肺部炎症,包括下调促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和MCP-1和上调抗炎细胞因子IL-10,达到保护MCMV感染小鼠肺组织、降低肺部病毒载量、减轻肺纤维化和延长小鼠生存期的作用。3、DSF治疗机制可能通过抑制巨噬细胞中NF-κB/NLRP3信号通路的激活,从而减轻MCMV感染小鼠肺部炎症和促进肺组织修复的作用。