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第一部分多西他赛诱导去势抵抗性前列腺癌细胞发生铁死亡目的 探索多西他赛诱导去势抵抗性前列腺癌细胞的死亡方式。方法 将CRPC细胞系PC3、DU145分别与多西他赛及铁死亡抑制剂ferrostatin-1和凋亡特异性抑制剂Z-VAD-FMK共培养,通过BODIPY?581/591 C11染色结合流式细胞术检测多西他赛处理后脂质ROS水平的变化;用对应试剂盒检测多西他赛处理后的CRPC细胞GSH、GPXs、MDA的变化;投射电子显微镜观察多西他赛处理后的CRPC细胞超微结构的形态;Western blot检测多西他赛处理后的CRPC细胞GPX4的蛋白水平。结果 CRPC细胞在经过多西他赛处理后,细胞内脂质ROS水平显著性升高,并且能被铁死亡抑制剂ferrostatin-1和凋亡特异性抑制剂Z-VAD-FMK逆转;此外,细胞内MDA含量增高,而GSH和GPXs下降,GPX4蛋白水平降低。通过透射电子显微镜观察显示多西他赛处理的CRPC细胞线粒体皱缩变小,线粒体膜密度增加,嵴减少甚至消失。结论 多西他赛可诱导CRPC细胞在形态、代谢和蛋白表达方面发生特征性改变,且细胞死亡可被铁死亡抑制剂逆转,说明多西他赛能诱导CRPC细胞发生铁死亡。第二部分Nrf2基因调节多西他赛诱导去势抵抗性前列腺癌细胞作用机制研究目的通过转录组测序筛选多西他赛诱导CRPC细胞铁死亡的作用靶点,并通过调控关键目标分子的表达水平,精准调节CRPC细胞对多西他赛化疗的敏感性。方法PC3对照组和多西他赛处理组进行转录组测序,对测序结果行生物信息学分析,根据差异表达基因及其关键信号通路研判,筛选出Nrf2基因。构建沉默Nrf2 CRPC细胞后,对照组和沉默组分别用多西他赛孵育,通过MTT检测细胞的增殖能力、流式细胞仪检测脂质ROS水平,Western blot检测GPX4表达,试剂盒检测GSH、GPXs和MDA水平,电子显微镜观察其超微结构。结果转录组测序以Padj＜0.05且log FC的绝对值＞1为筛选条件,测序共有1288个基因表达上调,780个基因表达下调,并对其中氧化应激调节基因行进一步筛选,筛选出Padj最小的Nrf2基因;基因集富集分析发现胆固醇自稳、p53信号通路、未折叠蛋白反应和m TORC1信号通路等都有明显富集,氧化应激相关基因热图也提示Nrf2、GPX4、PROX4等基因在多西他赛化疗诱导CRPC细胞铁死亡中发挥作用;沉默Nrf2组CRPC细胞对多西他赛化疗的敏感性增加,电镜显示沉默Nrf2组在铁死亡应激下线粒体皱缩和膜密度增加的CRPC细胞明显增多;沉默Nrf2组多西他赛作用CRPC细胞中MDA和ROS水平显著升高,并且GSH、GPXs水平显著下降。结论1.多西他赛通过经典GSH-GPX系统诱导CRPC细胞发生铁死亡。2.Nrf2基因在多西他赛诱导CRPC细胞铁死亡中起保护作用。第三部分多西他赛联合Tf R-CAR T活化去势抵抗性前列腺癌效应因子的表达目的构建Tf R-CAR T细胞,通过共孵育实验研究,探讨Tf R-CAR T细胞的抗肿瘤效应,为多西他赛联合Tf R-CAR T治疗前列腺癌奠定理论依据。方法通过Western blot检测对照组、多西他赛组、沉默Nrf2 CRPC细胞组、沉默Nrf2CRPC细胞联合多西他赛组中Tf R蛋白的表达;通过免疫组化分析HSPC和CRPC患者多西他赛化疗前后PD-L1、CD8和FOXP3表达;构建Tf R-CAR T细胞,将其分为4组,NC组、Tf R-CAR T组、多西他赛组和多西他赛联合Tf R-CAR T组,其中Tf R-CAR T与CRPC肿瘤细胞按照1:1、5:1和10:1的效靶比共孵育24 h,用MTT检测细胞的活性,流式CBA多因子检测技术检测共孵育培养Tf R-CAR T与CRPC细胞上清中细胞因子分泌情况。结果Western blot结果显示,多西他赛处理后Tf R蛋白表达增加,沉默Nrf2组Tf R蛋白表达下降;免疫组化结果显示HSPC和CRPC患者化疗后PD-L1和FOXP3无明显变化、CD8+T细胞浸润明显增加;通过MTT显示与单用多西他赛相比,多西他赛联合Tf R-CAR T对CRPC细胞有更强的杀伤能力;流式细胞术CBA多因子检测结果显示,单用多西他赛能使细胞因子分泌增强,Tf R-CAR T细胞的细胞因子分泌水平均高于NC细胞,而多西他赛联合Tf R-CAR T细胞因子分泌水平显著高于单用多西他赛组和单用TfR-CAR T组。结论多西他赛在CRPC细胞中增强Tf R蛋白水平表达;多西他赛化疗能改变HSPC和CRPC患者的肿瘤微环境;多西他赛联合Tf R-CAR T能提高杀伤细胞的能力,增加细胞因子的分泌。