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翅是昆虫生存所必需的器官,昆虫世界因有翅而绚丽多姿。但对害虫而言,翅反而是它们扩大为害的重要武器,如2016年由美洲经非洲入侵南亚多国并在去年袭扰我国的草地贪夜蛾和2019年始于东非并在最近肆虐中东和南亚地区的沙漠蝗虫等,飞行能力惊人,对农作物毁坏十分惨烈。那么,昆虫翅是怎样发生和如何调控的呢?这是昆虫学领域致力解决的一项重要内容。家蚕（Bombyx mori）是由野桑蚕驯化而来的鳞翅目有翅亚纲昆虫,因能大量产丝而被人类饲养利用逾5000年。与野桑蚕相比,家蚕的最大变化之一,是丧失了飞行能力,翅的颜色和斑纹等也严重退化,但昆虫翅的基本形态和发育特征仍在,因而被认为是研究昆虫翅发育调控机制和害虫防控策略的独特模型。家蚕翅发育是一个由众多基因调控的复杂过程。国内外早在1960年代就对家蚕翅发育调控机制展开探索并取得了较多进展,但是远未探明其调控机制。近年来,研究人员在果蝇中发现了一条名为Hippo的控制器官大小的重要信号通路,其下游的转录共激活因子Yki是信号传导的“开关”,通过入核或出核的方式开启或关闭下游靶基因的表达,从而调控器官的大小发育。Yki已被证实对果蝇翅发育具有重要调控作用,但在家蚕中其是否具有类似功能以及如何进行调控研究报道不多。在前期研究中,本课题组自家蚕中克隆了Hippo信号通路的转录共激活因子BmYki。为进一步探索BmYki调控家蚕翅发育的功能与机理,本论文首先构建了可在家蚕翅原基高量表达目的基因的GAL4/UAS转基因系,在此基础上制作了过表达、敲低和敲除BmYki的遗传素材,并对翅突变表型和BmYki的靶基因等进行了分析,取得了以下主要结果:1.翅原基高表达目的基因的GAL4/UAS转基因家蚕制作本课题组前期以家蚕肌动蛋白Actin4（A4）基因的近端启动子为调控元件,以EGFP为报告基因,分别制作了基于家蚕Nistari品系的GAL4基础转基因系A4-GAL4（AG4）和UAS基础转基因系UAS-EGFP（UEGFP）,但尚未分析A4启动子驱动EGFP表达的时空特征。本研究首先将AG4与UEGFP进行杂交,从其后代中筛选获得了阳性个体AG4/UEGFP,简写为EGFPOE。荧光观察结果显示,EGFP自胚胎第三天开始表达,一直持续到成虫期,其中在蛹期翅原基和内表皮这两个与家蚕翅发育密切相关的组织以及成虫翅和鳞毛处均有高量表达。观察五龄第五天EGFPOE家蚕的主要组织发现,EGFP在前后翅原基和内表皮中高量表达,脂肪体和气管中仅有少量表达,其它组织中未观察到EGFP表达。qPCR和Western blot检测结果与荧光观察结果一致。该结果表明,以A4为启动子的GAL4/UAS系统,是调控目的基因在家蚕翅原基高量表达的有效工具。2.BmYki过表达、敲低和敲除系统的制作本课题组前期已制作获得了用于过表达、敲低和敲除BmYki的UAS基础转基因系,包括UAS-BmYki、UAS-dsBmYki和UAS-BmYkiKO。本研究首先将三个UAS转基因系分别与AG4转基因系进行杂交,从其杂交后代中筛选获得了相应的GAL4/UAS阳性个体,依次命名为AG4/UAS-BmYki(YkiOE,过表达BmYki)、AG4/UAS-dsBmYki(YkiDS,敲低BmYki)和AG4/UAS-BmYkiKO(YkiKO,敲除BmYki)。基因组PCR和测序结果表明,上述过表达、敲低和敲除BmYki的系统均获成功,可用于下一步研究。3.BmYki诱导的家蚕翅原基（翅）突变表型分析以野生型家蚕为对照,分别对YkiOE、YkiDS和YkiKO家蚕翅原基（翅）表型进行调查,结果显示:（1）YkiOE幼虫个体变小,翅原基面积变小;成虫翅皱缩严重,手触干硬;前后翅粘连,几乎无鳞毛覆盖;体表鳞毛较少,触角和足仅有少量鳞毛覆盖;蚕蛾活动能力弱,部分蚕蛾无法爬离茧壳。（2）YkiDS和YkiKO突变表型与YkiOE相反,主要表现为幼虫翅原基和成虫翅面积变大,成虫个体变大。（3）YkiOE、YkiDS和YkiKO幼虫体重、蛹茧重、食桑量、生长周期、致死率和交配率等性状均受到不同程度的影响。这些结果表明,BmYki对家蚕翅发育具有重要调控作用。4.BmYki调控家蚕翅发育的分子机理初探为探索BmYki调控家蚕翅发育的分子机理,我们对蛹期第五天YkiOE和YkiDS的翅组织进行转录组测序分析,结果显示:（1）在YkiOE翅组织中有516个差异表达基因,其中302个上调表达,214个下调表达。在YkiDS翅组织中有165个差异表达基因,其中53个上调表达,112个下调表达。YkiOE和YkiDS翅组织中的共有差异表达基因为57个。（2）鉴定出4类差异表达基因与家蚕翅发育密切相关,分别为:3个翅模式决定基因（Dpp、ASH、Vg）,2个翅发育相关基因（Osiris、Notch）,5个激素信号相关基因（HR3、E74、Jheh-2、Bm3DE-3α-reductase、Bm3DE-3β-reductase）,以及33个翅原基表皮蛋白基因（CPR3、CPH9、CPFL、CPG9、CPT3和BmWCP10等）。荧光定量检测结果与此基本一致。该结果提示,翅模式决定基因、激素信号传导基因和表皮蛋白基因等是BmYki的下游靶基因,BmYki通过调节这些基因的表达从而调控家蚕翅发育。（3）以激素信号应答因子HR3和E74A为靶标,制作了转基因过表达系AG4/UAS-HR3(HR3OE)和AG4/UAS-E74A(E74AOE),发现过表达HR3和E74A均能导致家蚕成虫翅变小且卷曲,但突变程度较过表达BmYki略轻。该结果表明,经由激素信号应答因子调控家蚕翅发育,是BmYki行使功能的重要方式之一。综上,本研究在证实以A4为启动子的GAL4/UAS系统能够在家蚕翅原基（翅）中高量表达目的基因的基础上,以BmYki为靶标,制作了其过表达、敲低和敲除系,进而通过突变表型分析证实了BmYki是调控家蚕翅发育的重要因子,通过转录组测序鉴定了受BmYki调控的翅模式决定基因、激素信号传导基因、翅原基表皮蛋白基因等重要候选靶标,并对代表性候选靶标进行了转基因过表达验证。这些结果为阐明BmYki调控家蚕翅发育的分子机制打下了扎实基础,为开展家蚕翅发育研究提供了有用线索。