胆管癌（cholangiocarcinoma,CCA）是一种起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤,约占所有原发性肝脏恶性肿瘤的15%,近年来胆管癌在全球范围内的发病率逐年升高。CCA具有高度的异质性,可在胆道树的任何位置出现,根据CCA的解剖位置,可分为肝内、肝门周围、远端胆管癌（i CCA,p CCA和d CCA）。由于起病隐匿,早期通常无症状,且缺乏有效的诊断标志物,大多数患者被确诊时已处于晚期。目前针对胆管癌的临床治疗手段有限,手术治疗是早期患者的最佳选择,而中晚期患者主要以化疗为主。CCA的发生机制复杂,包括癌基因、抑癌基因、肿瘤转移的相关抑制基因以及调控粘附分子的基因在不同阶段参与CCA发生发展。随着基因组学及分子生物学的研究进展,不断有研究报道在CCA中发现新的分子标记物。胆汁淤积和慢性炎症导致胆管细胞恶变是CCA发生、发展的经典途径。慢性炎症会导致胆管细胞暴露的环境中不断增加白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、环氧化酶-2等炎症介质,进一步导致肿瘤抑制基因、原癌基因和DNA错配修复基因的进行性突变。另一方面,胆汁淤积会导致结合胆汁酸刺激生长因子的产生和分泌,并抑制细胞凋亡。在这种胆道系统环境下,多种原本呈低表达状态的原癌基因被激活后呈高表达,发生序列反应,破坏原癌基因控制的细胞内通路,进而导致细胞癌变。越来越多的证据表明,微小RNA（micro RNA,mi RNA）在介导肿瘤进展过程中起着不可或缺的调节作用。mi R-196-5p由mi R-196前体的5’端臂加工而来,报道显示mi R-196-5p在包括结直肠癌、卵巢癌和肝细胞癌中发挥作用。本研究在课题组前期生物信息学工作基础上,发现mi R-196-5p参与调控CCA侵袭以及转移的相关过程,我们首先结合公共数据库分析数据对mi R-196-5p在临床CCA中的表达情况进行了分析。明确其在不同临床特点CCA患者中的表达情况。接着分析了不同CCA细胞系中mi R-196-5p的表达情况,随后选择Hu CCT1细胞对mi R-196-5p在CCA中的调控机制进行分析。第一部分Mi R-196-5p在胆管癌临床样本中的表达以及患者临床特点的相关性目的:结合公共数据库分析数据,对mi R-196-5p在临床CCA中的表达情况进行分析。明确其在不同临床特点CCA患者中的表达情况,为mi R-196-5p在CCA临床诊断提供参考。方法:1.对来自于GEO中的两个公共数据集（GSE140001和GSE47764）进行分析。其中GSE140001数据集包含12例d CCA患者和3例匹配的非肿瘤性胆管上皮样本。GSE47764数据集包含3例人CCA样本及其相关的正常胆管组织。下载相关数据及矩阵文件比对两数据集最终的差异基因。2.本研究的CCA组织样本及匹配邻近胆管组织样本取自于从2019年3月截止到2020年12月,在河北医科大学第二医院接受CCA切除手术的患者。共收集56对CCA切除样本组织及匹配的邻近胆管组织。采用实时定量PCR检测样本中mi R-196-5p的表达。3.统计分析:应用Graph Pad 8.0软件进行统计分析,计量数据以均值±标准差表示;正态分布两样本均数间的比较采用t检验;非正态分布数据用秩和检验分析;P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.公共数据集GSE140001和GSE47764中共有4个mi RNA明显上调表达,其中就包括mi R-196-5p。2.同正常胆管组织相比,CCA样本中mi R-196-5p的表达明显上调。根据样本中mi R-196-5p表达的中位值,将mi R-196-5p分为高表达和低表达组,分析显示mi R-196-5p表达与CCA患者的性别、年龄没有相关性。mi R-196-5p高表达明显与以下的临床特征正相关:肿瘤直径≥5cm的、出现淋巴转移以及TNM分期为III-IV的患者。小结:mi R-196-5p在CCA中具有致癌作用,并且与肿瘤大小、肿瘤转移和TMN分期呈正相关,有可能作为胆管癌早期诊断、预后判断的新型生物标志物。第二部分调节mi R-196-5p对胆管癌细胞生物学功能的影响目的:mi R-196-5p的表达与CCA肿瘤大小和转移呈正相关。对改变mi R-196-5p在CCA细胞系中的表达探寻其生物学功能发生的变化,为进一步的机理研究奠定工作基础。方法:1.对Hu CCT1、QBC939和Huh-28三种CCA细胞系,以及人肝内胆管上皮细胞HIBEC中mi R-196-5p表达进行分析。并根据mi R-196-5p的表达情况,选择Hu CCT1用于进一步研究。2.利用构建的载体质粒,转染Hu CCT1细胞后,采用CCK8,Ed U法及细胞克隆形成实验以及细胞迁移和Transwell检测分析下调mi R-196-5p表达对CCA细胞增殖,侵袭和迁移的影响。结果:mi R-196-5p在CCA细胞系中表达上调,抑制mi R-196-5p后,CCA细胞的增殖,迁移及侵袭均受到了抑制。小结:CCA中上调表达的mi R-196-5p通过促进肿瘤细胞侵袭和迁移发挥调节作用。第三部分Mi R-196-5p促进胆管癌细胞增殖和迁移的信号通路目的:mi R-196-5p的表达与CCA肿瘤大小和转移呈正相关,因此我们推测mi R-196-5p可能通过调节CCA中的细胞增殖和迁移而发挥致癌作用。第三部分研究旨在对mi R-196-5p在这一过程中通路及调节过程进行进一步的研究。方法:1.文献检索及采用生物信息学分析工具,分析mi R-196-5p潜在的作用靶点。2.通过双荧光素酶报告基因实验,分析mi R-196-5p对靶基因HAND1的调节作用。3.进一步分析CCA临床样本中HAND1表达与患者临床特征的相关性。4.构建上调/下调表达质粒[包括HAND1过表达质粒（HAND1 OE）,β-catenin干扰序列（si-β-catenin）及阴性对照质粒],验证mi R-196-5p对靶基因及相关通路的调控作用,并分析调控通路对CCA细胞功能的影响。5.通过免疫细胞化学染色分析,对mi R-196-5p靶点通路关键蛋白在细胞质及细胞核中位置变化进行分析和结果验证。结果:1.生物信息学分析显示HAND1是mi R-196-5p的作用靶点.2.双荧光素报告基因分析验证了mi R-196-5p结合HAND1基因3’端抑制其表达。3.Rescure试验证实,沉默HAND1或β-catenin可逆转mi R-196-5p上调引起的细胞增殖和迁移功能增强。4.Western blot分析显示,下调mi R-196-5p明显抑制了细胞增殖标记物Ki67和间充质标记物N-cadherin的表达,沉默HAND1（HAND1-KO）或沉默β-catenin（si-β-catenin）均逆转了mi R-196-5p对上述蛋白的调节效果。5.细胞免疫化学分析显示,沉默HAND1（HAND1-KO）或沉默β-catenin（si-β-catenin）后,β-catenin从细胞核转移到细胞膜上,Wnt信号通路活性受抑制。小结:HAND1是mi R-196-5p的作用靶点,CCA中上调的mi R-196-5p进一步激活HAND1/Wnt/β-catenin信号通路,促进CCA细胞的增殖和迁移,导致CCA患者病情进一步发展。