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中华仙影海葵Cereus sinensis Verrill属于绿海葵科仙影海葵属,是我国沿海普遍分布的一种有毒海葵,也是一味常用海洋药物,具有收敛固涩、祛湿杀虫和滋阴壮阳等功效,民间主要用来治疗痔疮、脱肛、饶虫病和体癣等。中华仙影海葵触手内含有大量的刺丝囊,内含丰富的海葵毒素,主要为神经类和溶细胞类蛋白质或多肽毒素,这些毒素具有多种生物活性,一直以来都是海洋生物毒素研究的重要内容。本文以中华仙影海葵中的溶细胞毒素为研究对象,利用冻融、盐析、柱层析、电泳、HPLC及LC-MS对其进行提取、分离、纯化和鉴定;并进行了这类毒素的体外稳定性、抗肿瘤活性以及对小鼠的急性毒性试验。主要研究内容和结果如下: 1、中华仙影海葵溶细胞毒素的分离纯化及鉴定:采用正交试验优化出海葵溶细胞毒素的最适合提取方法,并利用硫酸铵盐析的方法得到初步纯化的海葵毒素,通过Sephadex G-100、Superdex75、Source15Q色谱分离、纯化得到一个含有两个多肽的纯度较高的溶细胞活性组分。经SDS-PAGE电泳检测,这两个多肽的分子量均在80 kDa左右,分别对这两个多肽进行LC-MS鉴定,结果显示这两个多肽的断裂片段相似,但在NBCI库中却无相似的多肽,故推测其为一类新型的海葵溶细胞毒素,该活性组分命名为CCT-Ⅰ。 2、CCT-Ⅰ的体外溶细胞活性及影响因素的研究:CCT-Ⅰ具有很强的溶细胞活性,其浓度大约在5.75μg·mL-1时便可以引起半数的2%大鼠红细胞混悬液的破裂。但过高或过低的孵育温度、强碱或强酸条件及随着放置时间的延长,都会导致CCT-Ⅰ溶细胞活性的降低;此外,不同的金属离子,如Cu2+,Mg2+,Zn2+和Ca2+都可以抑制CCT-Ⅰ的溶细胞活性,但EDTA对CCT-Ⅰ的活性具有保护作用,其保护作用具浓度依赖性。 3、CCT-Ⅰ的体外抗肿瘤活性的研究:采用MTT法研究了不同浓度的CCT-Ⅰ对人宫颈癌Hela细胞和肺癌A549细胞的抑制作用,结果显示:CCT-Ⅰ对这两株肿瘤细胞的生长都具有较强的抑制作用,对Hela肿瘤细胞和A549肿瘤细胞的半数抑制数分别为14.52μg·mL-1和22.18μg·mL-1,而且当CCT-Ⅰ的浓度为50μg·mL-1时,其对Hela肿瘤细胞和A549肿瘤细胞的抑制率均超过了70%。 4、CCT-Ⅰ对小鼠的急性毒性研究:采用小鼠尾静脉注射法研究了CCT-Ⅰ的急性毒性,得出CCT-Ⅰ对小鼠尾静脉注射的半数致死数为173.57μg/kg,虽然实验致死小鼠各内脏的表观形态与生理盐水对照组的差异并不明显,但组织切片显示实验组小鼠的肺部及肾脏发生病变,所以我们推测CCT-Ⅰ对小鼠毒性作用的靶器官可能是肺部和肾脏。 以上试验结果为中华仙影海葵溶细胞毒素的研究和后续开发提供了较为可靠的科学依据。