论文部分内容阅读
目的:本课题通过建立功能性消化不良（FD）大鼠模型,研究“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃动力的影响,明确推拿对FD的改善作用;进一步基于氧化应激的作用机制,从修复线粒体损伤、调控线粒体自噬,进而改善胃动力的角度对“通经调脏”推拿法治疗FD的机制开展深入研究,揭示其作用效果与氧化应激的内在联系及机制,为“通经调脏”推拿法在临床上的推广提供实验依据和理论基础。方法:1.“通经调脏”推拿法对FD大鼠一般状况的影响本实验采用不规律进食联合夹尾刺激法构建FD大鼠模型。治疗上,以“通经调脏”推拿法为治疗组;以促胃肠动力药物莫沙必利为阳性药对照组;同时设置正常对照组及模型组。实验过程中,观察并记录各组大鼠的日常状态;对进食量、饮水量和体重进行定期监测。通过以上研究,明确“通经调脏”推拿法对FD大鼠的一般状况的影响。2.“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃动力的影响实验结束后,检测各组大鼠胃排空率;通过Western Blot、荧光定量PCR及免疫组化法检测胃组织中酪氨酸激酶受体（c-kit）和缝隙连接蛋白43（Cx43）的表达情况;采用ELISA法检测胃组织腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量。通过以上研究,明确“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃动力的影响。3.“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃组织氧化应激的影响通过ELISA法检测胃组织活性氧（ROS）含量;采用比色法检测胃组织中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。通过以上研究,明确“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃组织氧化应激的影响。4.“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃组织线粒体损伤的影响运用透射电镜观察胃组织线粒体情况;通过Western Blot法检测胃组织AMPK-ULK1信号通路的表达水平。通过以上研究,明确“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃组织线粒体损伤的影响。5.“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃组织线粒体自噬的影响采用免疫荧光法检测胃组织中微管相关蛋白轻链3（LC3）和电压依赖性阴离子通道蛋白1（VDAC1）荧光共表达情况;通过Western Blot法检测大鼠胃组织自噬相关蛋白P62、LC3II/I及线粒体自噬相关通路PINK1-Parkin的表达水平。通过以上研究,明确“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃组织线粒体自噬的影响。结果:1.“通经调脏”推拿法对FD大鼠一般状况的影响实验结束后,模型组情绪抑郁、反应迟钝,活动量明显减小,鼠毛杂乱、枯黄,粪便呈黄绿色稀便,进食、饮水量及体重显著下降;与模型组相比,推拿组精神状态逐渐好转,活动量明显增大,鼠毛与正常组相差不大,粪便成形,质稍软,进食、饮水量及体重显著上升;莫沙必利组与推拿组相比,情绪较为抑郁,活动量小,其他方面无过多差异。提示“通经调脏”推拿法对FD大鼠的一般状态有明显的改善作用。同时,HE染色结果显示,各组大鼠胃组织均未出现炎症、溃疡等器质性病变,说明FD大鼠模型制备成功。2.“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃动力的影响胃排空检测是胃动力最直接的检测方法。结果显示:与正常组相比,模型组的胃排空率显著下降（P＜0.01）,提示在FD状态下,模型组的胃动力出现下降;而推拿组的胃排空率明显高于模型组（P＜0.01）。说明“通经调脏”推拿法能够恢复FD大鼠胃动力,进而改善FD的疾病状态。Cajal间质细胞（ICCs）是胃肠道的起搏细胞,其数量和网络结构异常是影响胃动力的重要因素之一。c-kit是ICCs的特异性受体;Cx43是连接ICCs与平滑肌的缝隙连接蛋白。两者的含量能够反映出ICCs的数量及网络结构。结果显示:与正常组相比,模型组Cx43和c-kit表达显著下降,提示在FD状态下,模型组ICCs的数量和网络结构出现异常;而推拿组Cx43和c-kit的表达明显高于模型组,且优于莫沙必利组。以上结果说明,“通经调脏”推拿法能够通过维持胃组织中ICCs的数量及网络结构,恢复胃动力,进而改善FD的疾病状态。ATP是生物体内最直接的供能物质,胃组织的能量供应下降能够影响FD大鼠胃动力。结果显示:与正常组相比,模型组ATP含量显著下降（P＜0.01）,提示在FD状态下,胃组织的能量供应出现下降的情况;而推拿组ATP含量明显高于模型组（P＜0.05）,说明“通经调脏”推拿法可以抑制FD大鼠胃组织中能量供应的下降,恢复胃动力,进而改善FD的疾病状态。3.“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃组织氧化应激的影响ROS的过度产生是氧化应激产生的主要原因,SOD和MDA作为评价这种应激水平的标志物,可直接反映出氧化损伤程度。结果显示,与正常组相比,模型组ROS和MDA含量显著上升（P＜0.01）,SOD活力显著下降（P＜0.01）,提示FD大鼠胃组织发生氧化应激;与模型组相比,推拿组ROS和MDA含量显著下降（P＜0.01）,SOD活力显著上升（P＜0.05）。说明“通经调脏”推拿法可以改善氧化应激状态。胃组织透射电镜的结果显示:与正常组相比,模型组细胞内线粒体数量减少,同时能够看到数量较多的破损线粒体及自噬溶酶体;与模型组相比,推拿组细胞内线粒体数量明显增多,破损线粒体及自噬溶酶体的数量减少。说明“通经调脏”推拿法能够减少胃组织氧化应激造成的线粒体损伤。AMPK-ULK1是引起自噬发生的重要信号通路。结果显示:与正常组相比,模型组磷酸化的AMPK和ULK1蛋白表达显著上升（P＜0.01）,提示氧化应激造成的线粒体损伤能够引起异常自噬的发生;而推拿组磷酸化的AMPK和ULK1蛋白表达明显低于模型组（P＜0.05）,与莫沙必利组表达情况基本相当。以上结果说明,“通经调脏”推拿法能够通过抑制胃组织AMPK-ULK1信号通路的激活,减少异常自噬的发生。4.“通经调脏”推拿法对FD大鼠胃组织线粒体自噬的影响P62和LC3是自噬发生的标志性蛋白,当自噬发生的时候,会出现P62的表达下降和LC3Ⅱ/Ⅰ的比例升高。同时,LC3与VDAC1荧光共表达能够反映出线粒体自噬水平。结果显示:与正常组相比,模型组P62表达水平显著下降,LC3Ⅱ/Ⅰ的比例显著上升,LC3与VDAC1总阳性面积显著上升（P＜0.01）,提示FD大鼠胃组织存在异常的线粒体自噬;与模型组相比,推拿组P62表达水平显著升高,LC3Ⅱ/Ⅰ的比例显著下降,LC3与VDAC1总阳性面积显著下降（P＜0.01）。上述结果说明,“通经调脏”推拿法能够改善胃组织中异常的线粒体自噬。PINK1-Parkin信号通路是线粒体自噬的泛素化依赖型途径。结果显示:与正常组相比,模型组PINK1和Parkin的蛋白表达显著上升（P＜0.01）,表明在FD状态下,胃组织中出现PINK1-Parkin信号通路被激活的现象,提示胃组织发生异常的线粒体自噬;而推拿组PINK1和Parkin蛋白表达明显低于模型组（P＜0.05）,与莫沙必利组基本相当。以上结果说明,“通经调脏”推拿法能够通过抑制PINK1-Parkin信号通路的激活,改善异常的线粒体自噬。结论:1.“通经调脏”推拿法不仅能够改善FD大鼠的精神状态、活跃程度、鼠毛及排便情况,还能够增加进食量、饮水量及体重,改善FD大鼠的一般状态。2.“通经调脏”推拿法能够通过抑制胃组织c-kit、Cx43的表达水平降低,维持ICCs的数量及网络结构;同时可以缓解胃组织中能量供应下降。恢复FD大鼠胃动力,改善胃排空能力,从而缓解FD的疾病状态。3.“通经调脏”推拿法能够通过抑制胃组织ROS含量上升,缓解SOD活力下降,减少MDA释放,从而改善氧化应激状态。4.“通经调脏”推拿法能够减少胃组织氧化应激造成的线粒体损伤,抑制AMPK-ULK1信号通路的激活,减少异常自噬的发生。5.“通经调脏”推拿法能够通过抑制胃组织AMPK-ULK1信号通路的激活,进而抑制PINK1-Parkin信号通路的活化,改善异常的线粒体自噬。6.“通经调脏”推拿法能够通过缓解胃组织氧化应激、修复线粒体损伤、调控线粒体自噬,进而恢复胃动力,改善FD的疾病状态。