热卡限制是指减少摄入热卡的20-50%且没有营养不良,是抗老化最经典的干预方法。大量动物研究结果表明短期热卡限制能够对心脏起保护作用:老年鼠进行短期热卡限制后改善老化引起的心室重构、心脏功能下降、线粒体功能障碍,减少氧化应激及凋亡。中年鼠进行短期热卡限制后线粒体氧化应激和氧化损伤减少,心肌缺血耐受改善。虽然众多研究结果表明青年开始进行短期热卡限制能够改善心肌缺血耐受性,改善代谢障碍者的心功能,然而,这些保护作用都基于心肌缺血再灌注等病理损伤模型或机体有肥胖或糖尿病等代谢紊乱基础。此外,一些研究发现,健康青年动物进行短期热卡限制并不能使心脏线粒体和心功能获益,甚至有研究发现对健康年轻人进行短期热卡限制能够导致心肌甘油三酯聚积,左室舒张功能下降。因此,是否所有短期热卡限制都同样有心脏保护作用目前研究结论并不完全一致。热卡限制开始的年龄,程度及心脏的基础情况均影响其对心脏的作用。不同年龄生理情况下心脏的基础不一,是否同样程度的短期热卡限制都能对心脏产生保护作用是一个值得探讨的问题。因此,本研究是从不同年龄进行短期热卡限制入手,观察各年龄阶段小鼠心脏结构和功能的改变以及热卡限制后心脏结构和功能方面出现的变化,从而明确短期热卡限制产生心脏保护作用的时机,并通过进一步的全基因组芯片和miRNA芯片找出可能的作用机制,为临床有针对地、有效延缓心脏老化提供新策略。本研究分为两个部分:第一部分:热卡限制对不同年龄小鼠心脏功能的影响第二部分:热卡限制调控不同年龄小鼠心脏功能的机制研究第一部分:热卡限制对不同年龄小鼠心脏功能的影响目的:热卡限制是延缓心脏老化的最经典的干预方法。早就有研究发现,老年进行短期热卡限制后改善老化引起的心室重构、心脏功能下降、线粒体功能障碍,减少氧化应激及凋亡。中年进行短期热卡限制后线粒体氧化应激减少,心肌缺血耐受改善。青年进行短期热卡限制能够改善心肌缺血耐受性,改善代谢障碍者的心功能,然而并不能使健康青年动物的心脏线粒体和心功能获益,甚至使健康年轻人舒张功能下降。因此,热卡限制开始的年龄,程度及心脏的基础情况均影响其对心脏的作用。我们的研究旨在明确同样程度的短期热卡限制对不同年龄小鼠心脏结构和功能的影响。方法:构建不同年龄短期热卡限制小鼠模型,我们将3月龄、12月龄、19月龄C57BL/6J雄性小鼠分别予自由饮食和热卡限制(总热卡减少40%)3个月,称体重及心脏重量,心脏二维超声评估小鼠心脏收缩功能。麦胚凝集素染色心肌细胞膜和实时荧光定量PCR检测心肌肥大标志基因的表达评估心肌细胞肥大。马松染色、实时荧光定量PCR检测心肌纤维化标志基因、Western Blot检测纤维化相关蛋白评估心脏纤维化。实时荧光定量PCR和Western Blot检测炎症因子的表达。电镜观察心肌线粒体数量及形态。实时荧光定量PCR检测端粒长度、老化标志基因,Western Blot检测老化标志蛋白。结果:随年龄增加,小鼠体重和心脏重量增加,心脏收缩功能出现下降,心脏结构出现重塑,包括心肌细胞肥大、心脏纤维化和炎症增加。同时在微观水平上线粒体受损增加,脂质浸润增加。心脏端粒缩短,老化指标增加。青中老年分别开始进行短期热卡限制对心脏影响不同。青年短期热卡限制使心脏收缩功能下降,中老年短期热卡限制延缓随龄下降的心脏收缩功能。青年短期热卡限制导致心肌细胞肥大、纤维化和炎症增加,中老年短期热卡限制改善心肌细胞肥大、纤维化和炎症。不仅如此,青年短期热卡限制导致心肌线粒体损伤增加,脂滴浸润增加,中老年短期热卡限制改善线粒体损伤,减少脂滴浸润。青年短期热卡限制导致端粒缩短,老化相关基因和蛋白表达增加,中老年短期热卡限制延缓老化导致的端粒缩短和老化指标的增加。结论:随年龄增加,小鼠心脏出现老化,心功能下降。青中老年分别开始进行短期热卡限制对心脏影响不同,青年短期热卡限制促进心脏功能下降和心室重构,促进老化指标的表达,而中老年短期热卡限制延缓心脏老化。第二部分:热卡限制调控不同年龄小鼠心脏功能的机制研究目的:既往众多研究发现热卡限制能够延缓心肌老化,预防相关心脏疾病,是有广泛的生化和细胞机制适应产生的,包括氧化还原稳态,线粒体功能,炎症,凋亡和自噬。并且很多营养敏感的蛋白在热卡限制的机制中被研究,包括:sirtuin,FOXOs,mTOR,AMPK等。这些营养敏感的信号通路的激活或抑制能够调节线粒体功能、氧化应激反应、炎症、凋亡或自噬等,从而对心脏产生保护作用。MicroRNA是一种进化上十分保守的、长度为18～25个核苷酸的小分子,在生理和病理的过程中发挥广泛而且关键的调控作用。近来,许多研究发现miRNA在心脏老化和疾病中具有令人吃惊的重要作用,目前已成为国内外学者关注的焦点。然而,热卡限制后心脏miRNA的变化及其可能的作用和机制却极少有研究。本课题的第一部分研究结果提示不同年龄短期热卡限制对心脏功能影响不同。因此,我们进一步深入研究了其可能的作用机制。方法:我们构建不同年龄短期热卡限制小鼠模型,将心脏组织送芯片公司进行全基因组芯片和miRNA芯片分析。首先筛选出3个年龄组热卡限制后明显上调和下调的基因(fold change≥1.5),并对这些基因进行Go和Pathway分析,筛选出青年热卡限制和中老年热卡限制后调控相反的信号通路,并用实时荧光定量PCR和Western Blot检测通路关键基因和蛋白。分析miRNA芯片,筛选出3个年龄组热卡限制后明显上调和下调的miRNA(fold change≥1.5),并用实时荧光定量PCR进一步验证并分析相关芯片信息。结果:全基因组芯片筛选出青年短期热卡限制和中老年短期热卡限制对FOXO信号通路产生了相反的调控。青年热卡限制抑制了 FOXOs及其下游自噬相关靶基因的mRNA表达,而中老年热卡限制促进FOXOs及下游自噬相关靶基因的mRNA表达。不仅在基因水平上,进一步验证蛋白结果也证实青年热卡限制抑制了自噬,而中老年热卡限制促进了自噬产生。青年热卡限制抑制了AMPK磷酸化,中老年热卡限制促进了 AMPK磷酸化,继而抑制或激活下游FOXOs信号通路。不同年龄短期热卡限制导致miRNAs变化不同,其中部分青年热卡限制下调而中老年热卡限制上调的miRNAs在既往研究中被认为能抑制炎症和纤维化。结论:不同年龄短期热卡限制对心脏老化影响不同的可能机制为:青年热卡限制抑制AMPK磷酸化,从而抑制FOXO信号通路,抑制下游自噬,中老年热卡限制促进了 AMPK磷酸化,激活FOXO信号通路,促进下游自噬的发生。不同年龄短期热卡限制导致miRNAs变化不同,其中部分与表型变化相关的miRNAs变化与既往研究结果一致。