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研究背景和研究目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的胃肠道恶性肿瘤,其发病过程隐匿,患者在首次确诊时常已发生转移,转移是患者的主要死因。化学药物治疗是结直肠癌转移患者的主要治疗方式之一,常用的化疗方案是奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)联合5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和甲酰四氢叶酸钙,该方案起初发挥较好疗效,但是,结直肠癌细胞常在治疗过程中发生化疗耐药而导致治疗失败。因此,研究结直肠癌转移以及化疗耐药具有重要临床意义。肿瘤侵袭、转移和治疗应答与肿瘤微环境相关,肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)作为肿瘤微环境的主要间质细胞,通过分泌外泌体、细胞因子、重塑细胞外基质等调控肿瘤发生、进展和治疗应答。但是,CAFs外泌体在结直肠癌侵袭、转移及耐药中的作用及分子机制尚不清楚。因此,本课题拟探讨CAFs外泌体在结直肠癌转移及5-FU/L-OHP耐药中调控作用及分子机制,为临床防治结直肠癌转移及化疗耐药提供新策略。研究方法采用酶消化法原代培养CAFs和正常成纤维细胞(Normal fibroblasts,NFs),超高速离心法分离CAFs和NFs条件培养基中的外泌体,并用透射电镜、Nanosight和Western blot方法鉴定外泌体;MicroRNA芯片筛选CAFs外泌体中转移及耐药相关miRNAs,并以双荧光素酶活性、Qpcr和Western blot方法筛选及验证其下游靶基因;采用Transwell Boyden chamber、Matrigel、细胞成球、平板克隆、CCK-8实验、TUNNEL实验和流式细胞术检测细胞体外迁移、侵袭、干性和凋亡;采用裸鼠盲肠原位种植实验研究CAFs外泌体促进肝转移的作用,裸鼠皮下成瘤实验研究CAFs外泌体诱导结直肠癌细胞5-FU/L-OHP耐药的作用。研究结果免疫荧光和免疫印记结果显示,α-SMA、FAP和FSP-1蛋白在结直肠癌CAFs中高表达,在NFs中低表达。体外功能实验显示,CAFs的条件培养基能促进结直肠癌细胞侵袭,诱导结直肠癌细胞对5-FU/L-OHP耐药。然后,我们采用超高速离心法收集CAFs及NFs外泌体并进行功能研究,发现CAFs外泌体能促进结直肠癌细胞侵袭、转移,维持癌细胞干性,诱导结直肠癌细胞对5-FU/L-OHP产生耐药性。对CAFs及NFs外泌体进行MicroRNA芯片分析,结合基因芯片、qPCR结果并查阅相关文献,选取miR-92a作为进一步研究对象。CAFs外泌体高表达miR-92a,结直肠癌细胞能摄取CAFs外泌体,增加癌细胞内的miR-92a水平,差异具有统计学意义(p<0.01)。生物信息学、双荧光素酶活性、Qpcr及Western blot实验显示,FBXW7和MOAP1是miR-92a的下游靶基因,功能研究显示,CAFs外泌体miR-92a通过抑制FBXW7和MOAP1,促进结直肠癌细胞侵袭和转移,维持癌细胞干性,诱导其对5-FU/L-OHP产生耐药性。结论1、CAFs通过外泌体促进结直肠癌细胞转移、维持干性以及诱导其对5-FU/L-OHP产生耐药性;2、CAFs外泌体中miR-92a通过靶向抑制FBXW7和MOAP1,促进结直肠癌细胞转移,维持干性以及诱导其对5-FU/L-OHP产生耐药性。创新性1、揭示一个新机制:CAFs外泌体中miR-92a通过靶向抑制FBXW7和MOAP1,促进结直肠癌细胞侵袭和转移,维持结直肠癌细胞干性,诱导其对5-FU/L-OHP产生耐药性;2、提出一个新靶点:CAFs外泌体miR-92a可作为抗结直肠癌转移及5-FU/L-OHP耐药的新靶点。