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第一部分:FOXO4通过抑制NF-κB信号通路减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤目的探讨FOXO4在心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation injury,H/R)损伤中的作用及对NF-κB信号通路介导的炎症反应的影响。方法适量H9c2心肌细胞均匀接种于六孔板,正常培养至汇合度达到30%。之后随机分为6组:对照组(Con组)、缺氧/复氧组(H/R组)、过表达FOXO4+缺氧/复氧组(FOXO4OE+H/R组)、过表达FOXO4阴性对照+缺氧/复氧组(OE-NC+H/R组)、沉默FOXO4+缺氧/复氧组(shFOXO4+H/R组)、沉默FOXO4阴性对照+缺氧/复氧组(shRNA-NC+H/R)。Con组细胞正常培养。H/R组细胞正常培养53小时后进行缺氧6小时随后复氧6小时处理。FOXO4OE+H/R组和OE-NC+H/R组以及shFOXO4+H/R组和shRNA-NC+H/R组细胞在质粒或RNAoligo转染5小时后正常培养48小时,再进行缺氧6小时随后复氧6小时处理。使用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,乳酸脱氢酶试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶含量。Western blot检测FOXO4,NF-κB蛋白的表达,实时荧光定量qPCR检测炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的mRNA表达水平。结果与Con相比,H/R组细胞存活率显著降低(P<0.01),培养液中LDH含量显著上升(P<0.01),FOXO4表达量显著下降(P<0.05),且NF-κB的蛋白表达量以及TNF-α,IL-1β,IL-6的mRNA表达均增加(P<0.01)。H/R对细胞带来的影响均被过表达FOXO4部分逆转(P<0.01或P<0.05)并且被沉默FOXO4进一步加重(P<0.01或 P<0.05)。结论FOXO4可以减轻H9c2心肌细胞的H/R损伤,其机制可能与抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应有关。第二部分:右美托咪定预处理通过α2受体改变小鼠心肌缺血再灌注损伤中FOXO4表达水平目的研究右美托咪定预处理能否通过α2受体改变小鼠心肌缺血再灌注损伤中心肌组织FOXO4蛋白表达水平。方法将雄性C57BL小鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、缺血/再灌注组(I/R组)、右美托咪定预处理组(DEX+I/R组)、阿替美唑+右美预处理组(Atip+DEX+I/R组)。Sham组小鼠暴露冠状动脉左前降支后接扎线绕过左前降支并不打结。I/R组小鼠左前降支结扎30min后恢复血流灌注24小时。DEX+I/R组小鼠在腹腔注射25μg/kg的右美托咪定1小时后按I/R组造模。Atip+DEX+I/R组小鼠在腹腔注射250μg/kg阿替美唑和25μg/kg的右美托咪定1小时后按I/R组造模。使用伊文蓝及2,3,5-三苯基氯化四氮醴(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)双染色法检测心肌缺血面积和梗死面积,Western blot检测FOXO4和NF-κB的蛋白表达量,实时荧光定量qPCR检测炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的mRNA表达水平。结果与Sham组相比,I/R组小鼠心肌缺血面积显著升高(P<0.01),FOXO4表达水平显著降低(P<0.01),NF-kB的表达水平显著升高(P<0.01),TNF-α,IL-1β,IL-6的mRNA水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。DEX+I/R组和I/R组相比,心肌缺血面积显著下降(P<0.01),FOXO4的蛋白表达水平显著增加(P<0.01),NF-κB的蛋白水平显著下降(P<0.01),TNF-α,IL-1β,IL-6的mRNA水平明显降低(P<0.01)。右美预处理的保护作用均被阿替美唑部分逆转(P<0.01)。结论右美托咪定预处理可以通过α2受体增加小鼠缺血再灌注的心肌组织中FOXO4蛋白表达水平,减少NF-κB蛋白分子的表达,对小鼠缺血再灌注的心肌提供抗炎作用。第三部分:细胞实验中验证FOXO4基因是否参与了右美托咪定预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用目的验证FOXO4是否参与了右美托咪定预处理在心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation injury,H/R)损伤中的抗炎作用。方法适量H9c2心肌细胞均匀接种于六孔板,正常培养至汇合度达到30%。之后随机分为4组:缺氧/复氧组(H/R组)、右美+缺氧复氧组(DEX+H/R组)、FOXO4基因沉默+右美+缺氧复氧组(shFOXO4+DEX+H/R组),基因沉默阴性对照+右美+缺氧复氧组(shRNA-NC+DEX+H/R组)。H/R组细胞正常培养53小时后进行缺氧6小时复氧6小时处理。DEX+H/R组正常培养52小时后用右美预处理1小时,再进行缺氧6小时复氧6小时处理,shFOXO4+DEX+H/R组和shRNA-NC+DEX+H/R组细胞以RNAoligo转染5小时再正常培养47小时,随后用右美预处理1小时再进行缺氧6小时复氧6小时处理。使用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,乳酸脱氢酶试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶含量,Western blot检测FOXO4和NF-κB蛋白的表达,实时荧光定量qPCR检测炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6的mRNA表达水平。结果与H/R组相比,DEX+H/R组细胞存活率显著升高(P<0.01),细胞培养液中LDH含量显著下降(P<0.01),DEX+H/R组细胞FOXO4的蛋白表达量显著升高(P<0.05),而 NF-κB 的蛋白表达量明显降低(P>0.01),TNF-α,IL-1β,IL-6 的 mRNA表达水平显著下降(P<0.01);右美对H/R组心肌细胞的上述保护作用均被沉默FOXO4基因部分逆转(P<0.05或P<0.01)。结论FOXO4通过调控NF-κB信号通路参与了右美预处理对缺氧复氧心肌细胞的保护作用。