背景:甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）近年来发病率持续增高,在近30年来增加了3倍,引起世界的广泛关注。尽管PTC整体预后较好,10年生存率超过90%至95%,但是,约3%-10%的PTC可呈侵袭性生长或出现广泛远处转移,该类患者通过手术+碘131治疗无法治愈,而且部分肿瘤在其发展的不同阶段出现碘治疗抵抗,预后极差（10年生存率不足10%,中位生存期不足5年）。目前,PTC的基因组图谱已完成绘制,系统展示了PTC的基因表达形态,确定的几个最常见的驱动子的突变:主要富集在MAPK信号通路上的BRAF（＞60%）和RAS（13%）。另外,最新被证实与PTC侵袭转移相关的突变基因有PPM1D、CHEK2、mi R-21、TERT以及DDR通路等。上述研究对认识PTC的发生发展有很大益处,但以上研究均是基于PTC的整体水平,而整块组织测序（bulky sequencing）的基因表达提供的信息是有限的,主要是由于其可能掩盖一些肿瘤内关键细胞之间的基因表达差异,即肿瘤内异质性,而肿瘤的异质性是PTC十分显著的特质之一。肿瘤的进化和异质性的存在导致临床病理同为PTC的患者,出现的临床病理特征和治疗效果不一。因此,在细胞水平建立PTC基因图谱对于理解PTC的异质性、进化特点及侵袭转移特征极为重要,新出现的单细胞转录组测序技术在一定程度上可以解决这些问题。单细胞转录组测序是在单个细胞水平上构建每个细胞的表达谱,揭示单个或某一亚群细胞的基因表达信息。近年来,单细胞转录组测序在癌症研究领域揭示转录组异质性、肿瘤侵袭与转移、肿瘤微环境、干细胞特性、耐药性、免疫分型和免疫逃逸等方面取得了关键性的突破。在乳腺癌、肝癌和恶性黑色素瘤等多种恶性肿瘤方面进行了深入的探索和发现。但在PTC上尚未进行深入研究。本研究拟先搜集临床典型的侵袭性PTC组织样本进行单细胞转录组测序,获得PTC单细胞水平的转录组图谱,寻找与侵袭转移相关的关键细胞亚群和基因;然后针对候选基因之一（CHI3L1）进行临床样本的mRNA和蛋白水平验证;最后,体外构建过表达与敲低CHI3L1表达的质粒载体,转染至PTC细胞株（TPC-1）,通过观察细胞在增殖、迁移与侵袭等方面的变化,探讨CHI3L1对PTC细胞生物学功能的影响。目的:1.通过PTC单细胞转录组表达图谱分析说明PTC的肿瘤异质性,同时寻找恶性程度高,有侵袭转移特征的关键细胞亚群及关键的差异表达基因。2.通过检测PTC临床组织标本中关键基因CHI3L1在mRNA和蛋白水平的表达,分析其与PTC临床病理特征的关系,验证其与PTC侵袭转移的相关性。3.通过体外构建过表达与敲低CHI3L1表达的质粒载体,分别转染至TPC-1细胞株,通过观察PTC细胞在增殖、迁移及侵袭等方面的变化,探讨CHI3L1对PTC细胞生物学特性的影响。方法:1.选取临床表现上两种典型的PTC患者:惰性发展型（PTC1）和侵袭进展型（PTC2）,采用组织特异性酶裂解法对PTC新鲜组织标本进行组织消化,制成单细胞悬液,采用10×Genomics平台进行单细胞转录组测序,通过生物信息学分析绘制PTC单细胞水平的转录组表达图谱,进行细胞亚群分类,拟时序分析肿瘤进化的细胞发展轨迹,寻找肿瘤侵袭转移的关键细胞亚群和基因。2.采用实时荧光定量反转录PCR（Reverse transcription Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）检测正常甲状腺2例、PTC无转移组2例、颈部淋巴结转移组5例和远处转移组5例共14例PTC组织标本中CHI3L1 mRNA的表达水平,分析CHI3L1 mRNA的表达与PTC转移的相关性。3.采用免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）的方法检测110例不同TNM分期的PTC石蜡包埋的组织切片中CHI3L1蛋白的表达水平,分析CHI3L1蛋白的表达与PTC临床病理特征的关系,探讨CHI3L1蛋白的表达与PTC侵袭转移的相关性。4.分别构建过表达与敲低CHI3L1表达的质粒载体,通过瞬转的方法转染TPC-1细胞株,与转染空白质粒对照相比,通过CCK-8、Ed U检测、平板克隆、Transwell等实验观察TPC-1细胞在增殖、迁移与侵袭等方面的变化,分析CHI3L1在PTC细胞中的生物学功能。结果:1.在建立PTC单细胞转录组图谱基础上,发现Epi02为PTC中恶性程度最高的细胞亚群,CHI3L1为该亚群中表达差异最大的基因。（1）通过对临床PTC样本进行单细胞转录组测序并建立PTC单细胞水平转录组图谱,定义了包括上皮细胞、巨噬细胞和肿瘤相关成纤维细胞等7个细胞亚群,其中上皮细胞亚群占75%,各细胞亚群功能不同,且彼此之间存在广泛的细胞间通讯。进一步对上皮细胞亚群细分后获得5个新的亚群（Epi01-05）,其CNV（copy number variation）水平、基因表达和功能的不同提示PTC内存在显著的肿瘤异质性。（2）Epi02亚群主要富集CNVs相对较高的水平,提示其恶性程度较高,而GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）富集分析进一步发现,Epi02富集的多数信号通路均是与肿瘤侵袭转移和分化相关的,包括细胞粘附、ECM-受体相关作用、m TORC1、p53、NF-KB、Wnt和KRAS等。同时,拟时序分析也发现,Epi02存在于细胞发展轨迹的末端,以上分析均表明Epi02是PTC内分化最差,恶性程度最高的细胞亚群。（3）分析Epi02细胞亚群的差异基因发现,其高表达的基因CHI3L1、CXCL14等与多种肿瘤的侵袭侵袭有关,COL1A1与上皮间质转化相关。同时,CHI3L1在PTC2（侵袭进展型）样本中的表达明显高于PTC1（惰性发展型）,在Epi02亚群中差异是最大的。（4）通过GSCA（Gene Set Cancer Analysis）生信分析发现,CHI3L1 mRNA在在多种恶性肿瘤中高表达,且参与多种恶性肿瘤侵袭转移的相关信号通路,如EMT、PI3K/AKT、RAS/MAPK和TSC-m TOR等。2.临床数据显示CHI3L1的高表达与PTC的侵袭转移密切相关（1）通过14例临床PTC组织样本的q RT-PCR发现,在mRNA水平,与正常甲状腺组织相比,PTC组织中CHI3L1的表达均有不同程度的升高,而且远处转移组较无转移组和颈部转移组有着更为显著的升高（P=0.015）。（2）通过110例临床PTC组织样本的免疫组化发现,在蛋白水平,CHI3L1在9例正常或良性甲状腺组织及8.2%（9/110）的PTC组织中呈阴性表达,在55.5%（61/110）的PTC组织中呈低表达,在36.3%（40/110）的PTC组织中呈高表达。而进一步对CHI3L1蛋白的表达与PTC临床病理特征的相关性进行单因素分析发现,CHI3L1蛋白的高表达与年龄（＜55 vs≥55,P=0.013）、T分期（P＜0.001）、N分期（P＜0.001）、M分期（P=0.007）及显著腺体外侵犯（P＜0.001）相关。3.功能研究显示CHI3L1的高表达增强PTC的增殖、迁移和侵袭能力通过体外细胞功能实验,分别构建了CHI3L1基因过表达（TPC-1-CHI3L1）和敲低表达的TPC-1细胞（TPC-1-sh CHI3L1）。（1）通过Western Blot检测证实,过表达组TPC-1-CHI3L1的CHI3L1蛋白表达量高于对照组TPC-1-Control（P=0.002）;而敲低组PTC-1-sh CHI3L1的CHI3L1蛋白表达量低于对照组TPC-1-sh Control（P=0.006）。（2）细胞增殖实验（CCK-8检测）显示,与对照组相比,TPC-1-CHI3L1细胞生长出现明显加速（P＜0.001）;相反的,TPC-1-sh CHI3L1细胞较对照组细胞（转染空载体）生长出现明显抑制（P＜0.001）,并且随时间的延长而日益显著。（3）Transwell迁移实验显示:与对照细胞相比,TPC-1-CHI3L1跨膜细胞数（248.65±4.56）显著升高（P＜0.001）,TPC-1-sh CHI3L1跨膜细胞数（69.56±6.43）显著下降（P＜0.001）。（4）Transwell侵袭实验同样显示:与对照细胞相比,TPC-1-CHI3L1侵袭细胞数（247.32±5.59）显著升高（P＜0.001）,TPC-1-sh CHI3L1侵袭细胞数（56.77±4.08）显著下降（P＜0.001）。结论:1.本研究通过单细胞测序建立的PTC单细胞转录组图谱特征充分展现了PTC内显著的肿瘤异质性,同时发现Epi02是PTC内恶性程度最高的细胞亚群,而在该亚群内,基因CHI3L1是PTC1和PTC2间表达差异最高的基因之一,且与肿瘤侵袭转移相关。2.CHI3L1在mRNA和蛋白水平的高表达均与临床PTC的侵袭转移特征密切相关。3.在甲状腺乳头状癌细胞株中过表达CHI3L1增强了细胞增殖、迁移和侵袭能力,对肿瘤的侵袭和转移起到促进作用;反之,敲低CHI3L1的表达则降低了细胞的增殖、迁移和侵袭能力,对肿瘤的侵袭和转移起到抑制作用。