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在要求种植牙的糖尿病患者,由于异常的高血糖状态大大降低了种植牙的成功率。因此,有效地控制血糖成为糖尿病患者牙种植治疗的关键。刘洪臣提出了人工种植牙给药假说,通过在特殊设计的种植体中,加入糖尿病治疗药物,即降低血糖,同时起到局部促进种植体骨结合的作用。为验证假说的可行性,提高糖尿病患者牙种植的成功率,观察糖尿病常用治疗药物对种植体局部骨细胞的代谢、增殖、矿化的影响并研究其作用机制十分必要。格列美脲是在临床广泛应用的第三代磺脲类降糖药。最近的研究发现,格列美脲不仅能作用于胰岛β细胞,也能作用于机体的其他细胞,如激活大鼠的脂肪细胞和骨骼肌细胞的胰岛素受体底物(IRS),导致IRS络氨酸磷酸化,从而激活PI3K/Akt通路,上调葡萄糖转运蛋白(GLUT)1,4表达,产生一系列的类胰岛素信号样作用。研究也发现,格列美脲在内皮细胞中能够激活PI3K/Akt通路,促进eNOS的活性。而eNOS在成骨细胞中也发挥着重要作用。目前,格列美脲对成骨细胞的影响,国内外未见报导。本实验采用了大鼠下颌骨来源的成骨细胞,观察格列美脲对高糖环境下其生物活性和葡萄糖摄取的影响,并探讨PI3K/Akt通路的作用,为格列美脲经人工种植牙给药提供实验依据。第一部分格列美脲对高糖环境大鼠下颌骨成骨细胞增殖、分化及矿化的影响目的:探讨格列美脲对高糖培养的大鼠下颌骨成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响。方法:分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别给予5.5mM(生理糖浓度)、16.5mM葡萄糖浓度的培养液培养,加入或不加入10μM格列美脲后,用噻唑蓝法(MTT)观察成骨细胞的7d增殖,生化法测定7d碱性磷酸酶(ALP)活性,Western blot检测7d和14dⅠ型胶原(ColⅠ)的表达,RT-PCR检测21d骨钙素(OCN)mRNA的表达。结果:高糖浓度降低了成骨细胞的增殖,ALP活性,OCN的mRNA的表达,提高了14d的ColⅠ的表达。格列美脲能够促进两种糖浓度下的成骨细胞的增殖,ALP活性,ColⅠ的蛋白表达和OCN的mRNA的表达结论:高糖浓度降低了大鼠下颌骨成骨细胞的增殖,分化和矿化,在两种糖浓度下,格列美脲促进大鼠下颌骨成骨细胞的增殖、分化和矿化。第二部分格列美脲对高糖环境大鼠下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取的影响目的:探讨格列美脲对高糖培养的大鼠下颌骨成骨细胞葡萄糖摄取和GLUT-1和GLUT-3表达的影响。方法:分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别用上述糖浓度处理细胞,持续24h,加入或不加入10μM格列美脲干预120min。采用氟-18(F-18)标记的脱氧葡萄糖(18F-FDG)测定成骨细胞的葡萄糖摄取,Western blot检测GLUT-1,3表达水平。结果:高糖浓度降低了成骨细胞的糖摄取能力和GLUT-3的表达,增加了GLUT-1的表达。格列美脲能够提高两种糖浓度下成骨细胞糖摄取的能力和GLUT-1,3的表达。结论:高糖环境能够影响大鼠下颌骨成骨细胞的葡萄糖转运。格列美脲能够促进两种糖浓度下大鼠下颌骨成骨细胞的葡萄糖转运。第三部分PI3K/Akt通路在格列美脲诱导大鼠下颌骨成骨细胞的作用目的:探讨格列美脲对PI3K/Akt通路上蛋白表达的影响,并观察PI3K/Akt通路对格列美脲诱导大鼠下颌骨成骨细胞的增殖、分化和糖摄取的作用。方法:分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别用上述糖浓度处理细胞,持续24h,加入10μM格列美脲,Western blot检测0min、15min、30min、60min、120min的PI3K P85、Akt/P-Akt、IRS-1/P-IRS-1的表达,加入或不加入10μM格列美脲和10μM LY294002干预,采用实验一和实验二的方法观察成骨细胞的7d增殖,7d ALP活性,7d和14d ColⅠ的表达,120min的葡萄糖摄取和GLUT-1,3的表达。结果:在两种糖浓度下,格列美脲促进了成骨细胞PI3K P85、Akt/P-Akt、IRS-1/P-IRS-1的表达。PI3K的特异性抑制剂LY294002显著性的抑制了格列美脲诱导的成骨细胞增殖,ALP活性,ColⅠ的表达,葡萄糖摄取和GLUT-1,3的表达。结论:格列美脲能够激活大鼠下颌骨成骨细胞PI3K/Akt通路,而且PI3K/Akt通路参与了格列美脲诱导的大鼠下颌骨成骨细胞的增殖、分化和葡萄糖转运的作用。第四部分格列美脲诱导的高糖环境下大鼠下颌骨成骨细胞eNOS表达的影响目的:探讨格列美脲在两种糖浓度下对大鼠下颌骨成骨细胞的eNOs表达的影响,以及PI3K/Akt通路所扮演的作用。方法:分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别用上述糖浓度处理细胞,持续24h,加入或不加入10μM LY294002干预30min后,再加入10μM格列美脲干预,Western blot检测0min、15min、30min、60min、120min的Akt/P-Akt、eNOS/P-eNOS的表达。结果:在两种糖浓度下,格列美脲能够通过PI3K/Akt通路激活下颌骨成骨细胞的eNOS活性。结论:在两种糖浓度下,格列美脲在大鼠下颌骨成骨细胞中能够经PI3K/Akt通路激活eNOS的活性。