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基因敲除是分析基因功能和构建动物模型的一种重要的分子生物学技术手段。自1989年第一只基因敲除小鼠诞生以来,基因敲除小鼠在生物科学领域得到了广泛的应用。在PubMed注册的基因敲除小鼠已经超过50000种。但是,目的基因的相关功能得到了质疑,因为目的基因的突变可能导致了代偿过程的负荷加重(上游或下游基因产物)从而引起二次表型的改变;此外,突变的表型经常仅在一些组织中比预测或者检测到的程度轻。一种解释可能是由于基因之间以及基因家族成员间的互补机制导致基因敲除而功能缺失不明显。基因的改变(基因敲除可看作基因突变)会引起相关的基因组结构和功能的改变,微卫星作为基因组结构中的重要组成成分,敲除基因诱导的二次表型的改变是否与微卫星多态性之间存在相关性?目前尚未见报道。为了研究微卫星多态性改变与基因敲除小鼠表型改变的关系,我们采用前期实验室筛选的42个多态性微卫星位点检测了近交系基因敲除小鼠基因组,观察是否存在微卫星的多态性;同时,我们从NCBI查找了18种敲除基因连锁的224个微卫星位点,进一步说明敲除基因所引发的相关微卫星多态性变化。
本实验分为三部分:
一、五个C57BL/6J小鼠生产群的微卫星检测及遗传学质量分析
为了解和分析国内几个主要C57BL/6J小鼠生产群的遗传质量状况,为生产单位对其进行遗传质量控制和管理提供依据,同时为第二部分的实验对照组消除遗传自然突变因素提供可靠的依据。我们采用本实验室筛选出的分布于17条常染色体和X染色体上的42个富含多态性的微卫星位点,通过PCR扩增和STR扫描的方法对北京、上海和南京三个地区5个单位提供的C57BL/6J小鼠进行遗传学质量分析。结果显示上海和南京地区2个单位的C57BL/6J小鼠在42个微卫星位点均呈现单态性。北京地区的3个群体中,京1群体的3号动物在D15Mit105位点上呈现群内多态性,并且该群体动物在D10Mit3位点与其余的4个群体呈现群间多态性。京2群体的8号动物在D14Nds1位点、6号动物在D2Nds3位点呈现群内多态性。京3群体的1号动物在D7Mit238位点呈现群内多态性。总之,上海和南京地区C57BL/6J小鼠遗传一致性良好,而北京地区的3个主要生产单位的C57BL/6J均存在遗传差异,需引起有关生产和使用单位注意。
二、近交系基因敲除小鼠中与敲除基因非连锁的微卫星多态性分析
本实验室前期通过基因修饰小鼠从198个微卫星位点筛选出了42个具有多态性的位点,这些位点分布在除Y染色体外的所有染色体中。在本研究中,我们进一步检测在基因敲除小鼠中42个微卫星位点的多态性。通过42个微卫星位点对29种基因敲除小鼠及野生型C57BL/6J和129品系小鼠作为对照组进行PCR扩增,STR扫描及直接测序的方法检测微卫星的多态性。实验结果显示在42个微卫星位点中有10个位点在11种基因敲除小鼠中呈现多态性(23.8%,(10/42))。核心序列为三核苷酸的D3Mit22在9号基因敲除小鼠中显示多态性。剩余的41个位点的核心序列均为二核苷酸,有9个位点呈现多态性(21.95%,(9/41))。另一方面,29种基因敲除小鼠有11种发生了多态性(37.9%,(11/29)),(TG)n为核心序列的二核苷酸表现多态性的比率最大(50%,2/4),依次为(GT)n(27.27%,3/11)和(CA)n(23.08%,3/13),(CT)n和(AG)n分别为20%(1/5)。根据克隆测序的结果,6种基因敲除小鼠呈现核心序列片段的插入,1种基因敲除小鼠则为缺失。有2个位点(D13Mit3和D14Mit102)在两种基因敲除小鼠中出现多态性,9号基因敲除小鼠在两个位点(D3Mit22和D13Mit3)呈现多态性。结果显示在近交系基因敲除小鼠中存在微卫星的多态性。
三、近交系基因敲除小鼠中与敲除基因连锁的微卫星多态性分析
从NCBI查找18种敲除基因连锁的微卫星位点224个进行引物合成,首先进一步优化这些位点的PCR扩增条件;经过条件优化后,以基因敲除小鼠为实验组,野生型C57BL/6J和129品系小鼠作为对照组对224个微卫星位点进行PCR扩增,STR扫描及直接测序的方法检测微卫星的多态性。实验结果显示与敲除基因Cekar连锁的微卫星位点D5Mit171呈现多态性(1/12,8.3%)。与敲除基因Nfkb1连锁的D3Mit256表现多态性(1/8,12.5%)。克隆测序的结果显示,D5Mit171与C57BL/6J比较有1个(TG)的插入,与129比较有1个(TA)的缺失,2个(TG)的插入;D3Mit256与C57BL/6J比较有1个(GA)和12个(AT)的插入,5个(AC)的缺失,与129比较为2个(GA)的插入,2个(AT)和1个(AC)的缺失。以上结果显示在近交系基因敲除小鼠中存在与敲除基因连锁的微卫星多态性。