【摘 要】
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目的:初步探讨胃癌细胞来源的外泌体在调控yδT细胞活性、凋亡以及细胞因子表达中的作用。研究外泌体miR-135b-5p在γδT细胞内的作用靶点,并初步探索相关分子机制。方法:1.收集人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MGC803的条件培养基,刺激γδT细胞,通过流式细胞术检测γδT细胞的凋亡率和细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达。2.使用外泌体提取试剂盒分离外泌体,透射电镜观察外泌体形态;通
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（项目编号:81802843,82073156,81672372）；
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目的:初步探讨胃癌细胞来源的外泌体在调控yδT细胞活性、凋亡以及细胞因子表达中的作用。研究外泌体miR-135b-5p在γδT细胞内的作用靶点,并初步探索相关分子机制。方法:1.收集人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MGC803的条件培养基,刺激γδT细胞,通过流式细胞术检测γδT细胞的凋亡率和细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达。2.使用外泌体提取试剂盒分离外泌体,透射电镜观察外泌体形态;通过纳米粒径跟踪分析测量外泌体的大小;Western blot法鉴定外泌体表面标志物。3.分别使用GES-1细胞和MGC803细胞来源的外泌体刺激γδT细胞,通过CCK-8实验检测γδT细胞的活性,运用流式细胞术检测γδT细胞的凋亡率和细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达。4.应用实时荧光定量PCR技术筛选出人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MKN45、SGC7901、MGC803细胞中差异表达的miR-135b-5p作为研究对象。应用实时荧光定量PCR技术检测胃癌细胞外泌体中miR-135b-5p的表达水平。5.通过慢病毒转染构建miR-135b-5p敲低（miR-135b-5p IN）的稳转MGC803细胞。将γδT细胞与miR-135b-5p IN MGC803细胞外泌体孵育,检测外泌体miR-135b-5p对γδT细胞功能的影响。6.运用生物信息学技术预测miR-135b-5p的下游靶点SP1;通过双荧光素酶报告实验、Western blot实验验证miR-135b-5p与靶基因SP1的结合。7.利用SP1抑制剂Plicamycin分析外泌体miR-135b-5p是否通过SP1调控γδT细胞的功能。结果:1.与GES-1细胞条件培养基处理的γδT细胞相比,MGC803细胞条件培养基处理的γδT细胞凋亡率上升（P＜0.01）,细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达显著减少（P＜0.05）。2.通过试剂盒提取的外泌体形态呈圆盘状,GES-1细胞外泌体和MGC803细胞外泌体分别在直径168 nm和174 nm处呈正态分布。Western blot结果显示外泌体表达标志物HSP70和CD63蛋白。3.与GES-1细胞外泌体处理的γδT细胞相比,MGC803细胞外泌体处理的γδT细胞的活性显著降低（P＜0.05）,凋亡率上升（P＜0.01）,细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达减少（P＜0.001）。4.与 GES-1 细胞相比,miR-135b-5p 在 MKN45 细胞（P＜0.05）、SGC7901 细胞（P＜0.05）和MGC803细胞（P＜0.001）中的表达水平显著升高。此外,miR-135b-5p在MGC803细胞外泌体中的表达水平显著高于其在GES-1细胞外泌体中的表达水平,差异有统计学意义（P＜0.001）。5.在miR-135b-5p敲低的稳转MGC803细胞（P＜0.001）和外泌体（P＜0.01）中,miR-135b-5p的表达水平显著降低。与对照MGC803细胞的外泌体处理的γδT细胞相比,miR-135b-5p IN MGC803细胞的外泌体处理的γδT细胞活性升高（P＜0.001）,凋亡率下降（P＜0.05）,细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达显著增加（P＜0.01）。6.SP1被4个生物信息学网站预测可能与miR-135b-5p结合。双荧光素酶报告实验表明miR-135b-5p可以直接与SP1的3’UTR区域序列结合。Western blot结果显示miR-135b-5p过表达显著抑制SP1的表达（P＜0.01）,而miR-135b-5p敲低显著促进SP1的表达（P＜0.001）。7.联合使用miR-135b-5p IN MGC803细胞的外泌体和SP1抑制剂Plicamycin刺激γδT细胞,结果表明,SP1抑制剂Plicamycin可以有效逆转miR-135b-5p IN MGC803细胞外泌体对yδT细胞活性（P＜0.001）、凋亡率（P＜0.01）和细胞因子IFN-γ和TNF-α表达（P＜0.001）的影响。结论:1.胃癌细胞通过分泌外泌体使γδT细胞的细胞活性降低、凋亡率上升,并使γδT细胞表达细胞因子IFN-γ和TNF-α减少。2.胃癌细胞外泌体来源的miR-135b-5p可以通过靶向SP1,调控γδT细胞的活性、凋亡和细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达。
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