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传染性脾肾坏死病毒（Infection spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）属于肿大细胞病毒属的成员,能感染鳜（Siniperca chuatsi）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）,致死率高,严重的危害鳜和大口黑鲈养殖业的发展,生产上急需研发高效、安全、方便的新型疫苗。1.基于杆状病毒表达系统研发抗ISKNV活载体疫苗及免疫效果评估为了构建基于杆状病毒的抗ISKNV活载体,将巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）启动子控制的ISKNV的主要衣壳蛋白（major capsid protein,MCP）的编码序列克隆到杆状病毒表达载体pFASTTMDual中,构建重组转移载体pFASTTMDual-CMV-MCP。通过 Bac-to-Bac 系统构建重组杆状病毒 BmNPV-MCP。将该重组病毒接种鱼EPC细胞,qPCR、免疫荧光、Western blotting检测结果显示,BmNPV-MCP可进入EPC细胞,并表达MCP蛋白。用 BmNPV-MCP 按8×109copies/尾免疫注射鳜（长 10～15 cm,体重 40～60 g）、大口黑鲈（长8～12 cm,体重35～55 g）。鳜免疫注射1周后,用PCR、qPCR进行检测,结果显示,BmNPV-MCP能进入鳜的肾和脾并表达MCP蛋白;鲈免疫注射1、2、3、4周后分别取脾和肾组织qPCR检测和取免疫3周的肾进行免疫组化检测,结果证明BmNPV-MCP能进入鲈的脾和肾,并表达MCP蛋白,进一步取免疫3周的鲈脾、肾组织,qPCR检测免疫相关基因的表达水平,结果显示免疫注射BmNPV-MCP后鲈的转化生长因子（TGF-β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素8（IL-8）、免疫球蛋白M（IgM）和白细胞介素1（IL-1）基因表达水平显著上升。ELISA检测结果显示,鲈免疫注射BmNPV-MCP 3周时抗体水平达到1:12800。在鲈免疫注射4周后,接种ISKNV进行免疫保护实验,结果显示,人工感染ISKNV后,鲈免疫注射BmNPV-MCP组的相对免疫保护率达87.1%;将鲈（长8～12 cm,体重35～55 g）用BmNPV-MCP重组病毒液（8 × 1011 copies）浸泡免疫3 h,在免疫4周后接种ISKNV,结果显示,BmNPV-MCP浸泡免疫的保护率约为61.3%。这些结果表明构建的重组杆状病毒BmNPV-MCP可以作为抗ISKNV的载体疫苗进行开发。2.抗ISKNV circRNA疫苗的设计及免疫效果评估mRNA疫苗是疫苗研发的新方向,但mRNA疫苗的稳定性差,需超低温保存和冷链运输,是mRNA疫苗必须面对的挑战。环状RNA（circular RNA,CircRNA）为共价闭合的环状单链RNA,结构稳定,不容易被RNase R和其它的核酸外切酶降解,能以帽子结构非依赖的方式通过核糖体进入位点（Internal ribosome entry site,IRES）起动蛋白翻译。N6-甲基腺苷（N6 methyladenosine,m6A）能募集核糖体促进翻译,因此circRNA具有开发成疫苗的潜力。为了研发抗ISKNV的circRNA疫苗,人工构建带有T7启动子的、由脑心肌炎病毒IRES和m6A位点序列控制的MCP编码序列（T7-IRES-m6A-MCP）的重组载体 pFASTTMDual-IRES-m6A-MCP,通过BamH I/Xba I 双酶切得到T7-IRES-m6A-MCP片段,该片段的体外转录产物用RNA连接酶连接制备circRNA circRNA-MCP。Western blotting和细胞免疫荧光结果显示,circRNA-MCP在鱼的EPC细胞中可表达重组MCP;用circRNA-MCP注射大口黑鲈（长8～12 cm,体重35～55 g）（50 μg/尾）,qPCR检测结果显示,circRNA-MCP能进入鲈肾和脾;ELISA结果显示,免疫注射3周后可检测到特异性抗体,效价为1:800-1600;免疫4周后的鲈接种ISKNV,结果显示,注射circRNA-MCP疫苗的相对免疫保护率为35.5%,表明circRNA可用于设计构建新型的抗ISKNV的RNA疫苗。