椎间盘退行性疾病(Degenerative disc disease,DDD)是一类与遗传、年龄、性别、职业、吸烟等多种因素相关的临床多发病。以椎间盘(intervertebral disc,IVD)内髓核细胞绝对或相对数量的减少为基础,进而导致髓核组织内II型胶原、蛋白多糖等重要细胞外基质成分及水含量的下降及椎间盘力学环境改变,这一过程是椎间盘退变性疾病的重要病理基础。而椎间盘作为人体最大的无血管无神经组织,其内部本身区别于人体其他组织低氧、高渗和低PH的局部微环境在退变的椎间盘中进一步恶化。在这种恶劣的环境下,虽然已被多个实验室的多个独立研究证实退变的椎间盘中像骨骼、肌肉、肝脏等组织器官一样存在着间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC),但退变的椎间盘却不能像受损的骨骼、肌肉、脂肪等组织一样有充分的能力通过募集、活化周围干细胞而完成自身的内源性修复。受限于椎间盘自身特殊的微环境,以及退变椎间盘中一些促进退变修复的生长因子的相对不足,椎间盘无法激活或募集足够的祖细胞或干细胞,可能是椎间盘内源性修复能力有限的一个重要原因。目前临床常用的激素冲击、消炎止痛、牵引理疗的保守治疗以及髓核摘除、减压融合的手术治疗等对症干预措施,从根本上讲都不能针对椎间盘退行性疾病病理基础而阻断其病程。而通过组织工程技术促进退变椎间盘内源性再生修复的理念让医学界看到了从根本上阻断椎间盘退变病程而修复再生椎间盘退变的可能。大量的体内外实验研究结果显示,生长因子之中骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)不但能在体外培养条件下显著减少椎间盘内髓核细胞的凋亡,更能在大白兔、犬等退变的动物椎间盘内促进蛋白多糖、II型胶原等重要基质成分的分泌、髓核水含量的升高及椎间高度的恢复。近年来诸多研究发现自组装多肽水凝胶材料RADA16-I(Ac N-RADARADARADARADA-CONH2)不但具备用做组织工程髓核材料的先天要素:1、类似髓核组织的超高含水量。2、可注射入椎间盘。3、在椎间盘的高离子盐浓度条件下自组装成适合细胞3D(3-dimensional)贴附的凝胶状纳米纤维支架结构。而且RADA16-I的C末端还可以加载修饰具有不同生物学功能的短的多肽片段(一般为15个片段以内的氨基酸短链),随之自组装后,修饰的多肽片段可暴露于纳米级多肽支架的表面,形成功能化的自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料,从而提高其生物学活性且特异性作用于特定组织细胞。研究显示,RADA16-I的C末端加载活性短肽使之功能化后其成胶性能会有所下降,但当其与RADA16-I以等比例混合后,其凝胶能力可基本恢复原有状态。目前基于RADA16-I这种生物学特性设计构建的功能化自组装多肽纳米纤维支架水凝胶支架材料已较为广泛的应用与骨、神经、心肌和血管再生等领域。同时,自2007年起Risbud,Feng,Blanco,Liu等先后证明了人体退变椎间盘、退变椎间盘的髓核、纤维环、软骨终板中存在与骨髓来源的MSCs具有相类似干性能力的间充质干细胞群。于是通过修饰有BMP-7功能片段的功能化组织工程髓核支架材料募集、激活退变椎间盘内的间充质干细胞,进而修复再生退变的椎间盘,可能会为椎间盘退行性疾病的生物对因治疗带来新的思路。本课题组前期分别将具有BMP-7重要生物学活性的三个功能片段SNVI(SNVILKKYRN),KPSS(KPSSAPTQLN),KAIS(KAISVLYFDDS)成功复合于RADA16-I的C末端合成功能化自组装多肽水凝胶RADA-SNVI,RADA-KPSS,RADA-KAIS,分别与RADA16-I以1:1混合后,制成新型功能化自组装多肽纳米纤维支架材料RADSNV、RADKPS和RADKIS。前期体外实验发现三者之中RADKPS能更好的募集退变髓核细胞向支架材料内迁移、促进其增值,并显著升高蛋白多糖、II型胶原等重要细胞外基质的基因表达和分泌。新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS是否能进一步在退变的椎间盘内协助募集、活化周围的间充质干细胞,提升细胞数量或活性,促进细胞增殖并分泌蛋白多糖、II型胶原等髓核内重要细胞外基质成分,这将关系到能否从病理基础上阻断椎间盘退变进程,从而促进退变椎间盘的内源性修复再生。正常的髓核组织本身是一种含水量为70%-85%的高度水化凝胶状粘弹性组织,故用于构建修复髓核组织工程的材料也应该具有类似正常髓核组织的生物力学特性。同时植入性生物多肽材料在体内实验实施之前必须检测明确其生物相容性从而确保体内的应用安全。为了进一步了解新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS的生物力学性能,并为明确新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS进一步用于动物甚至人体内实验的生物安全性提供实验依据,本课题设计了新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS的生物力学检测和生物相容性检测试验。目的:1、通过流变仪和原子力学显微镜检测载有BMP-7功能片段的新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS的生物力学性能。2、评价载有BMP-7功能片段的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS的生物相容性,为其在退变髓核再生领域中的体内研究提供实验依据。方法:1、原子力学显微镜检测功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS的弹性模量;流变仪检测RADKPS的流变学性能(粘弹性)。2、采用细胞毒性实验及新西兰大白兔离体椎间盘器官植入实验、溶血实验、昆明小鼠皮下注射实验、等分别检测新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS的细胞相容性、血液相容性及组织相容性。细胞相容性:以自组装多肽RADA16-I为原料,通过化学键链接BMP-7功能片段构建功能化自组装多肽RADA-KPSS,再与RADA16-I等比例混合制备新型功能化自组装多肽RADKPS。通过大体观察结构特点。分离培养3月龄新西兰大白兔BMSCs(骨髓间充质干细胞),取第3代BMSCs与RADKPS复合培养7 d,通过扫描电镜观察新西兰大白兔BMSCs在新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS内3D粘附情况;新西兰大白兔BMSCs-支架复合物培养后FDA/PI(fluorescein diacetate荧光素二乙酸盐/propidium iodide碘化丙啶)染色观察BMSCs细胞活性变化;MTT法检测细胞在新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS内的增值情况;6月龄新西兰大白兔离体椎间盘器官内植入新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS后FDA/PI染色观察椎间盘器官髓核内细胞活性。血液相容性检测:检测不同浓度RADKPS溶液对新西兰大白兔肝素抗凝静脉血的溶血率。溶血率<5%为不发生溶血,符合医用生物材料的溶血实验要求。组织相容性:将RADKPS植入6~8周龄昆明小鼠皮下28 d,行大体观察及HE染色观察评价新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS组织相容性。结果1、结果显示新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS的弹性模量为0.519±0.244KPa。流变仪证实1%RADKPS的储能模量(storage modulus,G’)均显著大于其损耗模量(loss modulus,G’’)。说明功能化自组装材料RADKPS为具有粘弹性的凝胶,而且RADKPS的G’和G’’均与剪切频率(shear frequency)无显著相关性,说明1%RADKPS凝胶材料形成纤维网状微结构。2、RADKPS在L-DMEM中成胶后呈均匀透明水凝胶状。扫描电镜示7d后西兰大白兔BMSCs伸出大量伪足紧紧粘附于新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS形成的纳米级3D孔隙结构内;RADKPS支架复合新西兰大白兔BMSCs 7 d后,扫描电镜示细胞在支架上黏附良好,细胞活性维持在90%以上;MTT检测示0.1%、0.05%、0.025%RADKPS溶液均不同程度促进新西兰大白兔BMSCs增殖;兔离体椎间盘器官培养致第7天时,实验组与空白对照组椎间盘内髓核细胞活性均在85%以上,以上都表明新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS具有良好的细胞相容性。溶血试验结果示,不同浓度RADKPS溶液相对溶血率均<5%,完全符合医用生物材料血液相容性指标。小鼠皮下注射实验结果示,28 d后注射局部皮肤无水疱、红斑及焦痂形成;HE染色示淋巴细胞等炎性细胞浸润,大量纤维结缔组织取代水凝胶支架,材料组织相容性良好。结论1、结果显示新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS成交后的弹性模量为0.519±0.244KPa,注入退变椎间盘成胶后能够为退变的椎间盘提供部分的初始力学支撑。RADKPS成胶后能自组装成具有纤维网状结构的粘弹性凝胶材料。RADKPS是一种具有类似髓核组织生物力学特征的支架材料。2、新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS具有良好的生物相容性和安全性,适合于髓核的组织工程修复与再生研究。这为新型功能化自组装多肽水凝胶支架材料RADKPS进一步用于退变椎间盘髓核组织组织工程内源性修复的体内实验提供了实验依据。