目的:生长板损伤（growth plate injury,GPI）,也称为骨骺损伤（epiphyseal injury）,是由创伤、感染等引起的长骨生长板损伤,会引起骨骺与干骺端之间形成骨桥,由此导致的肢体短缩与成角畸形一直是小儿矫形外科医师面临的重大挑战,至今尚无可靠的治疗方案。因此,明确生长板损伤骨桥形成过程中生长板软骨细胞稳态维持的具体作用机制,对寻找有效治疗或者预防生长板损伤的药物靶点具有重要意义。印度刺猬蛋白（Indian Hedgehog,Ihh）属于Hedgehog基因家族中的一种亚型,主要在表达于生长板前肥大层和肥大软骨细胞,在软骨发育与软骨稳态维持中发挥重要作用。目前关于Ihh在骨性关节炎（OA）中的研究已经较多,但其在出生后软骨发育的调控机制仍不清楚。本课题首先发现敲除Ihh加速生长板软骨细胞矿化,促进出生后生长板内源性骨形成。因此,我们推测:过表达Ihh可有效抑制生长板损伤后骨形成,进而修复损伤的生长板。本研究拟进一步明确过表达Ihh治疗生长板损伤的作用及其分子机制,以期为生长板损伤治疗提供新的治疗靶点。方法:1.建立Ihh可诱导条件性软骨细胞特异性敲除小鼠,将杂合子Ihh条件性敲除小鼠(Ihh Flox/+)与软骨细胞特异性表达Col2a1-Cre ERT2小鼠杂交,获得同时含有Ihh Flox/+;Col2a1-Cre ERT2小鼠,再将双杂合子小鼠与杂合子Ihh条件性敲除小鼠(Ihh Flox/+)交配一次,获得同时含有两个拷贝Ihh Floxflox和Col2a1-Cre ERT2的纯合子条件性敲除小鼠(Ihh Flox/flox;Col2a1-Cre ERT2,Ihhc KO)和对照小鼠(Ihh Flox/flox,Control)。于出生后第1天腹腔内注射1mg/10g/天Tamoxifen（TM）,连续注射2天。分别对出生后3天、7天、10天、14天的Control和Ihhc KO小鼠进行大体观察并拍照,动态测量小鼠的体长变化。使用Faxitron X线扫描仪对出生14天小鼠行全身X光扫描,并观察后肢生长板发育情况。采用Micro-CT对小鼠后肢标本进行计算机断层扫描,感兴趣区域（ROI）选自胫骨近端生长板区域,扫描结束后进行胫骨近端进行3D重建。在小鼠后肢标本固定完成后,梯度乙醇脱水,三氯甲烷透明,石蜡浸泡包埋,制作5μm厚度切片。常规脱蜡、复水,番红O/快绿（Safranin O/Fast Green）染色观察Ihh敲除后小鼠生长板软骨细胞生长发育情况。2.构建青春期野生型C57BL/6小鼠生长板损伤模型,损伤后立即于损伤部位注射Ihh-hydrogel混合药物(25μg重组Ihh蛋白溶解在313μl Vitro GelTM3D水凝胶中)。手术后8周处死小鼠,取小鼠胫骨近端进行组织切片观察;进一步构建青春期野生型SD大鼠生长板损伤模型,损伤后立即于损伤部位注射Ihh-hydrogel混合药物,术后2周使用小动物断层荧光扫描FMT监测Osteo Sence680EX成骨探针荧光表达情况,评估生长板损伤后新骨形成情况。使用番红O/快绿染色评估生长板损伤部位修复效果,免疫组化及激光显微切割技术评估修复组织性质;3.提取P3天C57BL/6小鼠乳鼠肋生长板软骨细胞,绿色荧光蛋白（GFP）标记的过表达Ihh（GFP-Ad-Ihh）和沉默Ihh（GFP-Ad-Ihh si RNA）腺病毒载体的体外扩增和转染体外培养的小鼠软骨细胞,确定转染成功后Trizol法提取细胞RNA。利用RNA-Seq观察过表达Ihh和沉默Ihh生长板软骨细胞差异基因表达,并进行GO分析和KEGG通路分析,RT-q PCR和WB等实验验证过表达及沉默Ihh对软骨细胞代谢、增殖及分化的影响。进一步分析RNA测序差异基因富集到的信号通路,验证Hedgehog信号通路与Wnt/β-catenin信号通路“Crosstalk”对生长板软骨增殖、分化及代谢的影响。结果:1.通过杂交并鉴定获得了Ihh软骨细胞特异性敲除小鼠,与Control小鼠相比,Ihhc KO小鼠P14天体重出现明显降低,小鼠体长和四肢出现明显短缩畸形;Faxitron X线见P14天Ihhc KO小鼠全身骨骼长度缩小,肢体短缩明显,胫骨近端骨骺、二级骨化中心以及生长板结构消失。Micro-CT三维重建见生长板提前闭合,骨骺发育异常,胫骨近端二级骨化中心提前消失,生长板区域骨化明显。番红O/快绿染色可见Ihhc KO小鼠P3天胫骨生长板软骨结构发育正常,静止区、增殖区、肥大区软骨细胞排列均匀,P7天见生长板扁平柱状排列的增殖区软骨细胞被少量肥大软骨细胞取代,P10天见生长板内软骨进一步成熟肥大,肥大层矿化,生长板结构缺失明显,P14天生长板软骨矿化现象延伸至骨骺干骺端大部分区域,生长板结构完全消失。Control组小鼠各时间点胫骨生长板软骨层次排列均匀,胫骨生长板发育正常。综上所述:敲除Ihh加速生长板软骨细胞矿化,促进生长板内源性骨形成。这提示我们:过表达Ihh可能阻止生长板损伤后骨桥形成,从而促进生长板损伤修复。2.Hydrogel组小鼠生长板损伤术后8周见缺损处骨桥形成,新生骨小梁填充,偶见少量新生软骨分布缺损周围,予以Ihh-hydrogel治疗后生长板损伤部位软骨原位再生,新生软骨簇形成并填充缺损部位。相比单纯Hydrogel组,Ihh-hydrogel治疗组软骨再生面积增加、Pineda评分降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。进一步建立大鼠生长板损伤模型,扫描电镜见损伤后生长板连续性中断,圆柱形缺损形成;缺损后予以碘佛醇-Hydrogel凝胶注射,Micro-CT扫描见高信号造影剂填充缺损处,证实Hydrogel药物可成功停留缺损位置。建立大鼠双侧生长板损伤模型,经Ihh-hydrogel治疗两周后,尾静脉注射生理盐水或成骨荧光探针Osteo Sence 680EX,FMT见双侧假手术+生理盐水组大鼠双侧膝关节无荧光信号,双侧假手术+Osteo Sence 680EX组双膝荧光强度基本一致;双侧Injury+Osteo Sence 680EX组双膝荧光强度基本一致;相比经单纯Hydrogel治疗（右侧）,经Ihh-hydrogel（左侧）治疗后荧光信号明显减弱,差异具有统计学意义（P＜0.05）;术后4周,Faxitron X线见假手术组胫骨近端骨骺线连续,未见骨骺钙化;单纯Hydrogel大鼠胫骨近端内侧骨骺损伤横跨骺线,损伤处病理性钙化,损伤区域骨骺闭合明显;相比Hydrogel组,Ihh-hydrogel治疗后见骨骺线连续性较好,损伤处见少量钙化,损伤区域骨骺未见明显闭合。损伤区域连续冠状面Micro-CT见单独Hydrogel治疗大鼠生长板的缺损部位骨桥几乎完全取代替代,经Ihh-hydrogel治疗后明显抑制骨桥的形成。术后8周,Faxitron X线及Micro-CT结果表明:相较Hydrogel组,Ihh-hydrogel治疗组大鼠骨桥形成较少,差异具有统计学意义（P＜0.05）;番红O/快绿染色见Ihh-hydrogel治疗组胫骨生长板损伤处原位生长板成簇再生并聚集填充缺损部位,生长板连续性好;相比单纯Hydrogel治疗组,Ihh-hydrogel治疗组软骨再生面积增加、Pineda评分降低（P＜0.05）。免疫组化Ihh-hydrogel治疗组缺损填充组织高表达Col2a1,单纯Hydrogel偶见少量Col2a1阳性区域。石蜡组织显微切割后RT-q PCR结果证实:与Hydrogel组相比,Ihh-hydrogel治疗组缺损处修复组织Col2a1、Aggrecan表达水平较高,Runx2、Col10a1及Osterix表达降低。3.小鼠生长板软骨细胞被成功分离及体外培养,体外成功扩增含GFP-Ihh腺病毒载体并转染小鼠软骨细胞,Western Blot证实过表达Ihh和沉默Ihh腺病毒载体均成功转染。RNA-Seq分析结果提示:相较于对照组,过表达Ihh上调基因359个,下调基因370个;相较于对照组,沉默Ihh上调基因336个,下调基因394个。GO分析差异基因主要富集在软骨发育、分化等生物过程,进一步KEGG富集发现Hedgehog通路与Wnt/β-catenin信号通路之间存在“Crosstalk”现象,共同调控生长板软骨细胞代谢功能。体外实验发现过表达Ihh促进GLI1、PTHr P、Col2a1、Aggrecan、Sox9表达升高;缺失Ihh激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进Col10a1、Runx2、ADAMTS5表达升高。结论:1.Ihh功能性缺失加速生长板软骨细胞矿化,促进生长板内源性骨形成,导致生长板发育障碍;2.外源性过表达Ihh抑制生长板损伤后骨桥形成,并促进生长板软骨原位再生进而修复损伤的生长板;3.Ihh介导Hedgehog信号通路和Wnt/β-catenin信号通路之间发生“Crosstalk”,共同调控生长板软骨细胞代谢功能。