第一部分FNDC5/鸢尾素通过促进肝星状细胞Rab27b泛素化降解进而抑制其外泌体释放目的:肝纤维化是肝脏对损伤刺激的异常修复过程,其特征表现为肝星状细胞（HSCs）的活化和细胞外基质（ECM）的沉积。外泌体（EVs）作为细胞间通讯的关键媒介已被证实能够参与肝纤维化进程的调控。鸢尾素（Irisin）是由纤维连接蛋白Ⅲ型结构域包含蛋白5（FNDC5）裂解分泌的片段,是一种主要由骨骼肌释放到循环血中的肌动素。近期有研究发现Irisin可能参与了小鼠非酒精性脂肪肝肝纤维化进程的调控。然而,对于Irisin如何减轻肝纤维化及其分子机制、Irisin对活化HSCs外泌体释放及其调控机制目前尚不明确。为此,本研究观察了FNDC5/Irisin对HSCs基因表达谱的影响,并从外泌体释放的角度探索Irisin对活化HSCs的影响及其分子机制。方法:（1）从健康C57BL/6小鼠肝脏中分离出原代HSCs,使用Zetasizer Nano系列粒度仪通过动态光散射（DLS）分析外泌体的大小分布。（2）以三种不同处理方式（溶剂PBS、20ng/m L PDGF-BB、20ng/m L PDGF-BB+100ng/m L Irisin）处理原代小鼠HSCs 12h,采用超速离心法（Ultra-centrifugation）分离外泌体,采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术检测PDGF刺激活化的HSCs释放的外泌体大小、形态及数量,并采用蛋白免疫印迹（WB）检测外泌体区别于微囊泡的标记物TSG101和CD81的表达水平来进行验证;以观察Irisin对PDGF刺激活化的HSCs外泌体释放的影响。（3）提取各组HSCs的总RNA,使用Agilent生物频谱分析仪检测RNA,用Illumina m RNA Tru SEQ定向文库试剂盒生成RNA-Seq（转录组测序技术）文库,并使用Illumina Hi SEQ4000进行测序,以RNA-Seq测序筛选三种不同方式处理后的原代小鼠HSCs差异表达的基因谱,并采用基因集富集分析（GSEA）对相关信号通路进行富集分析,观察Irisin对PDGF-BB刺激活化HSCs基因表达谱的影响,探讨其调控的可能的机制及靶基因。采用WB验证三种不同处理后HSCs及其释放的外泌体中Pdgfra和Pdgfrb蛋白的表达情况。（4）采用透射电镜（TEM）观察三种不同处理后的原代小鼠HSCs中的多泡体（MVB）及腔内囊泡（ILV）的形态和数量。采用CD63作为MVB的标记物进行免疫荧光（IF）技术分析三种不同处理后HSCs中MVB的亚细胞分布情况。用WB检测验证HSCs中CD63蛋白的表达情况。（5）采用蛋白质质谱分析（PMS）三种不同处理后的原代小鼠HSCs中Rab GTPase家族成员的蛋白表达,并以WB检测三种不同处理后HSCs中Rab27a和Rab27b蛋白表达情况,同时以实时荧光定量聚合酶链反应（q RT-PCR）分析HSCs中Rab27a及Rab27b的m RNA表达水平。（6）采用蛋白合成抑制剂放线菌酮（50μg/m L CHX）、自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（10μmol/L Baf A1）和泛素蛋白酶抑制剂乳胞素（10μmol/L Lac）预处理小鼠原代HSCs 8h后,分别再采用20ng/m L PDGF-BB和20ng/m L PDGF-BB+100ng/m L Irisin处理12h,收集各组HSCs,以WB检测Rab27b蛋白表达。进一步采用免疫共沉淀（Co-IP）检测原代小鼠HSCs中Rab27b泛素化水平。结果:（1）Zetasizer Nano系列粒度仪通过动态光散射（DLS）分析发现原代小鼠HSCs释放的外泌体的平均直径约为100nm。（2）纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术检测显示,与PBS对照组相比,PDGF-BB组中原代小鼠HSCs释放的外泌体的数量明显增多（P＜0.05）;而PDGF-BB+Irisin组与PDGF-BB组相比,HSCs释放的外泌体的数量明显减少（P＜0.05）;但不同处理组对外泌体的大小和形态均没有产生明显影响（P＞0.05）。WB检测结果显示,与细胞裂解液对照相比,TSG101和CD81在外泌体中的蛋白表达水平显著升高,且在外泌体中没有检测到内质网蛋白钙连蛋白（Calnexin）;与对照组相比,PDGF-BB组外泌体中TSG101和CD81的浓度明显升高（P＜0.05）;PDGF-BB+Irisin组外泌体中TSG101和CD81的蛋白表达较PDGF-BB组明显降低（P＜0.05）。（3）RNA-Seq测序发现PDGF-BB组和PDGF-BB+Irisin组间共存在3,611个表达明显差异的基因,其中1,556个基因下调,2,055个基因上调。KEGG通路分析发现,差异表达的基因主要在促炎症和促纤维化相关通路显著富集。以WB验证结果显示,PDGF-BB处理后的HSCs及其释放的外泌体中Pdgfra和Pdgfrb蛋白表达水平均显著升高,但PDGF-BB+Irisin处理后仅逆转了HSCs及其释放的外泌体中Pdgfra表达的增加,而不影响Pdgfrb表达的增加。（4）采用透射电镜（TEM）观察显示,与对照组相比,PDGF-BB组和PDGF-BB+Irisin组中HSCs内的MVB的数量和MVB中ILV的数量都显著增多（P＜0.05）;而PDGF-BB+Irisin组较PDGF-BB组HSCs内的MVB的数量和MVB中ILV的数量增多更为显著,差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫荧光（IF）结果显示,与对照组相比,PDGF-BB组和PDGF-BB+Irisin组中每个HSCs的CD63阳性斑点数量均显著增多（P＜0.05）,而PDGF-BB+Irisin组较PDGF-BB组中CD63阳性斑点数量增多更为显著,差异有统计学意义（P＜0.05）。WB检测结果也表明Irisin处理组的HSCs中CD63的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。（5）蛋白质质谱分析（PMS）和WB检测的结果显示,与对照组相比,PDGF-BB组原代小鼠HSCs中Rab27a和Rab27b蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,尤以Rab27b表达升高最为显著;与PDGF-BB组相比,PDGF-BB+Irisin组中Rab27b蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,Rab27a表达降低不明显。然而,q RT-PCR结果显示,与对照组相比,PDGF-BB组的HSCs中Rab27a m RNA表达轻度升高,但差异无统计学意义（P＞0.05）,Rab27b m RNA表达明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;与PDGF-BB组相比,PDGF-BB+Irisin组中Rab27a及Rab27b的m RNA表达水平没有明显变化（P＞0.05）。（6）WB检测结果显示,无论是否采用PDGF-BB和PDGF-BB+Irisin处理,与对照组相比,CHX组和CHX+Baf A1组的HSCs中Rab27b蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,而CHX+Lac组与CHX组和CHX+Baf A1组相比,HSCs中的Rab27b蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。进一步Co-IP实验的结果显示,与PDGF-BB组相比,PDGF-BB+Irisin组、PDGF-BB+Lac组及PDGF-BB+Irisin+Lac组的HSCs中的Rab27b蛋白表达水平均明显高表达（P＜0.05）,而PDGF-BB+Irisin+Lac组与PDGF-BB+Irisin组和PDGF-BB+Lac组相比,HSCs中的Rab27b蛋白表达高水平更为显著（P＜0.05）。这些结果表明Lac可以抑制Rab27b降解,而Baf A1则不能;并且无论Lac存在与否,Irisin处理组的Rab27b的泛素化水平均显著升高（P＜0.05）。结论:（1）Irisin可以减少PDGF-BB诱导活化的HSCs来源外泌体释放,但对外泌体形态及大小不产生影响。（2）Irisin通过增加Rab27b的泛素化降解抑制HSCs内MVB中ILV的透膜过程,这可能是Irisin影响HSCs来源外泌体释放数量减少的分子机制之一。第二部分FNDC5/鸢尾素处理的活化肝星状细胞外泌体体外抑制受体肝星状细胞活化目的:目前有研究显示,HSCs来源的外泌体可能参与了肝纤维化的进程,但外泌体在这个过程中如何参与调控肝纤维化发展及Irisin处理后活化HSCs外泌体如何发挥作用目前尚不明确。因此本部分重点观察了活化HSCs产生外泌体被受体HSCs摄取的动态进程,并进一步探讨了活化HSCs来源的外泌体对于受体HSCs迁移能力的影响,探讨Irisin处理后的HSCs来源外泌体对受体HSCs活化的调控。方法:（1）按照第一部分方法从健康C57BL/6小鼠肝脏中分离出原代HSCs,通过不同处理小鼠原代HSCs获得不同组外泌体100μg（数量约为1×10~9个）,用PKH26对其标记后,分别与小鼠原代HSCs（1×10~6个）共孵育1h、3h、6h,采用免疫荧光观察受体HSCs对外泌体的内吞作用情况。（2）将三种不同处理方式（溶剂PBS、20ng/m L PDGF-BB、20ng/m L PDGF-BB+100 ng/m L Irisin）处理小鼠原代HSCs12h后分离得到的不同组外泌体,分别取100μg（数量约为1×10~9个）,与1×10~6个小鼠原代HSCs共孵育24h,收集各组HSCs,分别检测以下指标:（a）WB检测不同处理获得的外泌体对受体HSCs Pdgfra蛋白的表达情况。（b）qRT-PCR检测各组受体HSCs细胞外基质（α-SMA和CollagenⅠ）和炎症因子（TNF-α和IL-1β）相关的基因表达,验证不同处理活化HSCs来源的外泌体对受体HSCs活化的调控作用。（3）采用划痕实验观察不同处理获得的外泌体对受体HSCs迁移能力的影响,分别在0h、24h采取图像,采用Image J软件测量细胞边界距离。结果:（1）受体HSCs与PKH26标记的供体HSCs来源的外泌体分别共孵育1h、3h、6h,免疫荧光结果显示,外泌体在1h开始被受体HSCs摄取,3h后摄取明显增加,持续到6h达到最大,有时间依赖性。（2）当受体HSCs与三种不同处理方式处理的HSCs来源的外泌体共孵育时,与空白（Vehicle EVs）组相比,活化（PDGF-BB EVs）组外泌体处理的受体HSCs中Pdgfra的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;与活化（PDGF-BB EVs）组比较,Irisin处理（PDGF-BB+Irisin EVs）组的受体HSCs中Pdgfra的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。（3）q RT-PCR分析结果显示,与对照（Vehicle EVs）组相比,活化（PDGF-BB EVs）组受体HSCs的α-SMA、CollagenⅠ、TNF-α和IL-1β的m RNA表达显著升高（P＜0.05）;与活化（PDGF-BB EVs）组相比,Irisin（PDGF-BB+Irisin EVs）组受体HSCs的α-SMA、CollagenⅠ、TNF-α和IL-1β的m RNA表达显著降低（P＜0.05）。（4）划痕实验结果显示,与对照（Vehicle EVs）组相比,活化（PDGF-BB EVs）组受体HSCs迁移能力显著提升（P＜0.05）;而Irisin（PDGF-BB+Irisin EVs）组与活化（PDGF-BB EVs）组相比,受体HSCs迁移能力明显降低（P＜0.05）。结论:小鼠原代HSCs对活化HSCs来源的外泌体具有内吞能力,且有时间依赖性。Irisin处理的活化HSCs来源的外泌体也能够被受体HSCs摄取,并通过旁分泌方式显著抑制受体HSCs的活化,Irisin的这一作用可能与其外泌体调控受体HSCs Pdgfra信号转导及改变纤维化和炎症基因表达有关。第三部分腹腔注射FNDC5/鸢尾素通过调节肝内免疫细胞分布及炎症因子基因改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化目的:前期的研究已经表明,Irisin在体外可以通过调节活化HSCs内Rab27b蛋白泛素化,抑制活化HSCs外泌体释放;同时,Irisin处理的活化HSCs释放的外泌体可以通过旁分泌的方式抑制受体HSCs活化的作用。为探究Irisin在体内对小鼠肝纤维化有无改善作用,本部分通过构建野生小鼠和FNDC5基因敲除(FNDC5-/-)小鼠的肝纤维化模型,观察Irisin对CCl4诱导小鼠肝纤维化改善作用及可能的作用机制。方法:野生小鼠和FNDC5基因敲除(FNDC5-/-)小鼠各18只,分别随机分成三组:橄榄油对照组、CCl4组、CCl4+Irisin处理组。橄榄油对照组小鼠每周2次腹腔注射等量的橄榄油,CCl4组和CCl4+Irisin组小鼠每周2次腹腔注射0.01m L/g含10%CCl4的橄榄油,连续8周造模。从实验第一周开始,CCl4+Irisin组小鼠在注射CCl4的同时每天腹腔注射生理盐水配制的重组人Irisin 0.5mg/kg/d,在橄榄油对照组和CCl4组小鼠同时给与等量的生理盐水腹腔注射。最后给药24h后,所有小鼠戊巴比妥（100mg/kg）麻醉处死,留取血液及全部肝脏。分离血清,取各小鼠肝右叶组织约3mm×3mm,4%中性甲醛固定,其余肝组织置﹣80℃冰箱保存。检测以下指标:（1）常规病理切片,HE、Masson、天狼猩红染色,观察各组小鼠肝脏病理学改变。（2）qRT-PCR和WB分别检测各组小鼠肝脏Rab27b和Pdgfra的m RNA及蛋白表达情况。（3）免疫荧光观察和WB检测各组小鼠肝脏细胞外基质蛋白α-SMA和CollagenⅠ的表达情况。（4）q RT-PCR检测各组小鼠肝脏细胞外基质蛋白α-SMA和CollagenⅠ以及炎症性细胞因子TNF-α和IL-1β的m RNA表达情况。（5）采用流式细胞术检测各组小鼠肝脏中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、M1（CD11c+）型巨噬细胞、M2（CD206+）型巨噬细胞的水平。结果:（1）在野生型小鼠中,HE、Masson、天狼猩红染色镜下病理形态学观察发现,CCl4组小鼠肝脏与对照组比较有明显肝细胞脂肪变性,纤维结缔组织增生,出现明显肝纤维化表现;而Irisin处理组小鼠肝脏中肝细胞变性及纤维化程度较CCl4诱导的小鼠明显减轻。在FNDC5-/-小鼠中,CCl4组小鼠肝脏与相应对照组而言,肝细胞脂肪变性及纤维化表现明显,且纤维化表现也明显较野生型CCl4组小鼠严重;Irisin处理可明显改善FNDC5-/-小鼠CCl4诱导的肝纤维化,但改善程度不及野生型小鼠。（2）q RT-PCR检测结果显示,在野生型和FNDC5-/-小鼠中,与橄榄油组相比,CCl4组小鼠肝脏Rab27b m RNA和Pdgfra m RNA表达均明显升高（P＜0.05）;与野生型小鼠CCl4组相比,FNDC5-/-小鼠CCl4组肝脏中Rab27b m RNA及Pdgfra m RNA表达升高均更加明显（P＜0.05）。在野生型和FNDC5-/-小鼠中,CCl4+Irisin组肝脏中Rab27b m RNA表达与CCl4组相比均没有明显变化（P＞0.05）,但是Pdgfra m RNA表达均较CCl4出现明显下降（P＜0.05）,但仍高于对照组。WB检测结果显示,在野生型和FNDC5-/-小鼠中,与橄榄油组相比,CCl4组小鼠肝脏的Rab27b及Pdgfra的蛋白表达均明显升高（P＜0.05）,尤以FNDC5-/-小鼠Rab27b升高更为明显。CCl4+Irisin组小鼠肝脏中Rab27b的蛋白表达水平与CCl4组相比明显降低（P＜0.05）,且FNDC5-/-小鼠下降更为明显;在野生型小鼠中CCl4+Irisin组小鼠肝脏的Pdgfra的蛋白表达水平与CCl4组相比明显降低（P＜0.05）;而在FNDC5-/-小鼠中,CCl4+Irisin组小鼠肝脏中Pdgfra的蛋白表达水平与CCl4组相比无明显变化（P＞0.05）。（3）免疫荧光结果显示,与橄榄油组相比,在野生型和FNDC5-/-小鼠CCl4组均可见纤维化标志蛋白α-SMA（红色）和CollagenⅠ（绿色）显著表达,尤以FNDC5-/-小鼠明显;而在Irisin处理均能够显著降低这两种蛋白表达的荧光强度,但是FNDC5-/-小鼠降低不如野生型。WB检测结果显示,在野生型和FNDC5-/-小鼠中,CCl4组小鼠肝脏的α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达与橄榄油组相比均明显升高（P＜0.05）;CCl4+Irisin组小鼠肝脏的α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达与CCl4组相比水平均明显降低（P＜0.05）,但是,在FNDC5-/-小鼠Irisin处理后对肝α-SMA和CollagenⅠ缓解程度不如野生型小鼠。（4）qRT-PCR的结果显示,在野生型和FNDC5-/-小鼠中,与橄榄油组相比,CCl4组可见小鼠肝脏α-SMA m RNA、CollagenⅠm RNA、TNF-αm RNA、IL-1βm RNA表达均明显升高（P＜0.05）;与CCl4组相比,CCl4+Irisin组小鼠肝脏α-SMA m RNA、CollagenⅠm RNA、TNF-αm RNA、IL-1βm RNA表达均明显降低（P＜0.05）。（5）流式细胞分选结果显示,在野生型和FNDC5-/-小鼠中,与橄榄油组相比,CCl4组小鼠肝脏中CD8+T淋巴细胞的数量明显增加（P＜0.05）,CD4+T淋巴细胞的数量明显减少（P＜0.05）;Irisin处理明显恢复CD4+T淋巴细胞的数量减少,但对CD8+T淋巴细胞的数量增加的逆转不明显。在两种小鼠中,与橄榄油组相比,CCl4组小鼠肝脏中致炎M1（CD11c+）型巨噬细胞数量明显增加（P＜0.05）,抗炎的M2（CD206+）型巨噬细胞数量明显减少（P＜0.05）;Irisin处理明显恢复M2（CD206+）型巨噬细胞数量明显减少和野生型CD11c+巨噬细胞的数量增加,但在FNDC5-/-小鼠Irisin对CD11c+巨噬细胞的数量增加的逆转作用不明显。结论:（1）腹腔注射Irisin可以改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化进程,其机制可能与调节肝内免疫细胞分布,减少炎性相关基因表达,调控肝脏外泌体分泌有关。（2）体内FNDC5基因缺失可以进一步加快小鼠肝纤维化发展,且Irisin的治疗效果与体内FNDC5基因调控功能相关。第四部分FNDC5/鸢尾素通过调控HNRNP A1的稳定性及内质网应激进而抑制肝星状细胞活化和肝纤维化目的:内质网应激（ERs）及ERs激活的未折叠蛋白反应（UPR）已被证明是肝损伤、炎症和纤维化的驱动因素,也是急性和慢性肝病发展过程中常伴发的一个重要反应。有研究发现,ERs可以通过诱导异质核核蛋白A1（HNRNP A1）降解参与纤维化发展进程。在上面的研究中我们已经证实了Irisin对活化HSCs外泌体释放及肝纤维化进程的影响,但Irisin对HSCs活化中一个重要的环节ERs及HNRNPA1的表达调控目前尚不明确。因此,本部分的研究拟通过观察Irisin对HNRNP A1蛋白稳定性及ERs的调控,从ERs的角度探讨其改善肝纤维化的机制。方法:（1）体外培养小鼠原代HSCs,分别用100 ng/m L Irisin或等体积PBS处理HSCs 12d,每组设三复孔,于实验开始及第12d收集HSCs,提取蛋白,采用WB检测Irisin对HSCs的ERs相关蛋白GRP78、PERK及其磷酸化表达、CHOP的调控作用。（2）体外培养人肝星状细胞株LX-2,用100 ng/m L Irisin或等体积PBS预处理细胞2h,再用2μg/m L衣霉素（Tun）共孵育12h,诱导细胞ERs,收集细胞,提取蛋白,WB检测PERK、p-PERK及HNRNP A1蛋白表达。（3）将FLAG-HNRNP A1转染进LX-2细胞,转染完成后用100 ng/m L Irisin及等体积的PBS分别预处理细胞2h,再以2μg/m L Tun共孵育12h,将细胞暴露50μg/m L CHX,在指定时间（0h、1h、3h和6h）收集细胞,免疫印迹WB法检测各时间点细胞HNRNP A1蛋白表达水平,绘制FLAG-HNRNP A1的半衰期曲线。（4）用Trans Fast转染试剂Lipofectamine 2000转染PERK过表达质粒入LX-2细胞,确定转染效能后,后用100 ng/m L Irisin或等体积PBS预处理细胞2 h,然后再以2μg/m L Tun共孵育12 h,收集细胞,WB法检测各组LX-2细胞中p-PERK、PERK及HNRNP A1蛋白的水平。（5）用Trans Fast转染试剂Lipofectamine 2000将短发夹RNA（shRNA）HNRNP A1干扰序列（sh RNA-HNRNP A1）及其阴性对照序列sh RNA-NC转染入LX-2细胞。转染后用100 ng/m L Irisin或等体积PBS预处理细胞2h,然后再以2μg/m L Tun共孵育12 h,用免疫荧光染色检测LX-2细胞HNRNP A1和α-SMA的表达,并采用q RT-PCR检测LX-2细胞中TGF-β、α-SMA、Collagen I、TIMP-1m RNA的水平,用WB法检测LX-2细胞Collagen I、GRP78和CHOP蛋白表达水平。（6）取第三部分三种不同处理的野生型小鼠肝脏病理切片,采用免疫荧光染色的方法观察p-PERK、HNRNP A1、α-SMA在肝脏内的表达定位。（7）基于野生型小鼠和HNRNP A1-/-小鼠,分别按照0.01m L/g体重腹腔注射溶于橄榄油的10%CCl4,每周2次,共8周,构建CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型,从CCl4注射的第一天开始,CCl4+Irisin组也每天腹腔注射生理盐水配制的重组人Irisin 0.5mg/kg/d,橄榄油对照组和CCl4组小鼠也分别给与等量的生理盐水腹腔注射。实验结束后杀鼠取血及肝脏,常规病理切片,天狼猩红及Masson染色观察小鼠肝组织纤维化情况。采用WB检测各组小鼠肝脏中肝纤维化及ERs相关蛋白（α-SMA、Collagen I、GRP78和CHOP）的表达情况。结果:（1）与刚分离的小鼠原代HSCs（静止态）相比,培养12d HSCs（活化态）中GRP78、p-PERK、PERK和CHOP、α-SMA、Collagen I蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;与培养12d小鼠原代HSCs相比,加Irisin处理HSCs中GRP78、p-PERK、PERK和CHOP、α-SMA、Collagen I蛋白表达水平明显下调（P＜0.05）。（2）WB检测LX-2细胞p-PERK和PERK蛋白与HNRNP A1蛋白表达水平的结果显示,与对照组相比,Tun处理组中p-PERK和PERK蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）,HNRNP A1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）;Irisin处理组中p-PERK和PERK蛋白表达水平较Tun处理组明显降低（P＜0.05）,HNRNP A1蛋白表达水平较Tun处理组明显升高（P＜0.05）。（3）CHX处理后分析HNRNP A1蛋白的稳定性的结果显示,在对照组中,FLAG-tagged HNRNP A1的蛋白表达水平随时间延长3 h开始降低,6 h出现明显降低;Tun处理组FLAG-tagged HNRNP A1的蛋白表达水平1 h就开始出现下降,6h几乎消失,可见Tun处理加速了FLAG-tagged HNRNP A1的降解;而Irisin预处理组明显减缓了FLAG-tagged HNRNP A1的蛋白表达水平这一过程。（4）在Tun暴露条件下,LX-2细胞的p-PERK和PERK蛋白表达水平明显升高,HNRNP A1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）,与前面结果一致;Tun+Irisin处理后LX-2细胞的p-PERK和PERK蛋白表达水平与Tun组相比明显降低,而HNRNP A1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;转染PERK过表达质粒的LX-2细胞与Tun+Irisin处理组相比,细胞的p-PERK和PERK蛋白表达水平明显升高,HNRNP A1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。（5）细胞免疫荧光染色结果显示,Tun可以诱导LX-2细胞α-SMA表达,下调HNRNP A1的表达（P＜0.05）;Irisin处理能够有效抑制Tun诱导的LX-2细胞中α-SMA表达升高和HNRNP A1的表达降低（P＜0.05）。但是,在转染sh RNA-HNRNP A1之后的LX-2细胞,Irisin处理抑制Tun诱导的LX-2细胞中α-SMA表达升高和HNRNP A1的表达降低的作用消失,其表现模式与Tun组一致。q RT-PCR结果显示,与对照组相比,Tun处理组LX-2细胞中TGF-β、α-SMA、Collagen I和TIMP-1的m RNA表达显著升高（P＜0.05）;Tun+Irisin处理组LX-2细胞中TGF-β、α-SMA、Collagen I和TIMP-1的m RNA表达与Tun处理组相比显著降低（P＜0.05）;转染sh RNA-HNRNP A1处理组LX-2细胞中TGF-β、α-SMA、Collagen I和TIMP-1的m RNA表达与Tun+Irisin处理组相比显著升高（P＜0.05）。WB结果显示,与对照组相比,Tun处理组LX-2细胞中Collagen I、GRP78和CHOP的蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）;与Tun处理组相比,Tun+Irisin处理组LX-2细胞中Collagen I、GRP78和CHOP的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）;Tun+Irisin+sh RNA-HNRNP A1处理组LX-2细胞中Collagen I、GRP78和CHOP的蛋白表达水平与Tun+Irisin处理组相比明显升高（P＜0.05）。（6）组织免疫荧光染色检测结果表明,在野生型CCl4组小鼠的肝脏组织中p-PERK和α-SMA表达水平及在HSCs中共定位强度显著高于橄榄油对照组小鼠;CCl4+Irisin处理组小鼠p-PERK和α-SMA的表达水平及在HSCs中共定位强度明显较CCl4组减弱。野生型小鼠肝脏HNRNP A1与α-SMA共定位观察结果表明,与橄榄油组相比,CCl4组小鼠的肝脏组织中HNRNP A1表达显著降低,而CCl4+Irisin处理组小鼠肝脏组织中HNRNP A1表达部分恢复,且与α-SMA在HSCs中共定位强度也有明显增加。（7）天狼猩红和Masson染色的小鼠肝脏病理组织学结果显示,在野生型小鼠可见CCl4诱导明显肝纤维化,Irisin治疗可明显改善小鼠肝纤维化程度（P＜0.05）;而在HNRNP A1-/-小鼠,同样CCl4可诱导较野生型更为明显肝纤维化,且给与Irisin治疗后纤维化改善明显不如野生型小鼠（P＜0.05）。WB检测结果表明,与野生型小鼠相比,HNRNP A1-/-进一步诱导了α-SMA、Collagen I、GRP78和CHOP在CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠肝脏组织中的表达,而Irisin在HNRNP A1-/-小鼠中对这些蛋白的抑制作用也显著弱于在野生型小鼠中效果（P＜0.05）。结论:（1）Irisin可以通过抑制HSCs的ERs蛋白PERK介导的HNRNP A1蛋白降解,进而调控HSCs活化及细胞外基质产生而发挥其改善小鼠肝纤维化作用。（2）HNRNP A1是HSCs的ERs信号蛋白PERK的一种新的中间底物,也是Irisin发挥改善小鼠肝纤维化作用的一个关键蛋白。