背景及目的:炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）,主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎,是一种累及回肠、直肠、结肠的特发性肠道炎症性疾病。IBD患者常常表现出腹泻、腹痛和肛周出血。IBD的发病机制目前尚未完全明了,但已证实IBD受累肠断区域由于血管受损和代谢需求增加而长期处于缺氧状态。因此,越来越多的证据表明缺氧诱导因子-1（Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）可能是肠道炎症的关键调节因子。HIF-1是缺氧应答中起重要作用的转录因子,由两个亚基组成HIF-1α和HIF-1β。作为基因调节蛋白,HIF-1α可以促进各种相关基因的表达,介导与缺氧有关的各种适应性反应,如:削弱肠道炎症、保护粘膜屏障、缺氧组织新生血管生成、红细胞生成、促进糖酵解、诱导或抑制凋亡等方面发挥重要作用。先前的研究已经报道,HIF-1α有助于维持肠道内稳态和防御肠道病原体,可以保护肠粘膜细胞与线粒体损伤后缺血再灌注损伤,此外,HIF-1α也是维持肠上皮细胞紧密连接完整性的核心。然而,HIF-1α调节肠道炎症的具体分子机制仍不清楚。近来,越来越多的证据显示,HIF-1α在免疫细胞功能和发育过程中具有重要作用。研究报道,肠道树突状细胞来源的HIF-1α能够影响调节性T细胞的数量和功能,而调节性T细胞的发育也依靠HIF-1α的内部表达。肠道免疫稳态依赖于共生细菌、粘膜免疫细胞和肠上皮细胞相互间的密切调控,而稳态破坏则会导致肠道功能失衡、病理改变,如IBD。已证实,肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECs）来源的细胞因子参与调节肠道先天免疫和获得性免疫过程。有研究报道,上皮来源的IL-7、IL-15、IL-18能够影响上皮间淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes,IELs）亚群构成,而上皮分泌的胸腺基质淋巴细胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin,TSLP）和转化生长因子β（Transforming growth factor-β,TGF-β）则能够调控树突状细胞和肥大细胞功能。但是,对于肠上皮来源的HIF-1α如何影响周围免疫细胞,目前尚未清楚。因此本课题拟应用qRT-PCR、细胞流式分析等技术,通过建立葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate,DSS）诱导的溃疡性结肠炎动物模型,来探讨肠上皮来源的HIF-1α在炎症性肠病的作用,以及对周围淋巴细胞数量及功能的影响,阐明上皮细胞参与调控淋巴细胞的部分分子机制,进而为肠道免疫稳态的维持提供新的理论依据。方法:1.通过葡聚糖硫酸钠处理7天,建立实验溃疡性结肠炎小鼠模型,利用免疫荧光技术检测肠道HIF-1α蛋白表达情况,并观察肠炎条件下其表达改变;2.利用肠上皮特异性HIF-1α敲除(HIF-1α^IEC)小鼠与同窝HIF-1α^+f/+f小鼠,建立溃疡性结肠炎小鼠模型,每天监测小鼠体重,观察粪便形状改变,有无血便,7天后,测量结肠长短改变,计算疾病活动指数（disease activity index,DAI）,HE染色观察结肠炎症严重程度,qRT-PCR监测炎症相关因子改变;3.脱颈处死小鼠后,分离小肠和结肠,提取肠上皮间淋巴细胞和固有层淋巴细胞（lamina propria lymphocytes,LPLs）,利用细胞流式分析技术检测上皮间淋巴细胞亚群改变,表面抗原改变;检测固有层调节性T细（Regulatory T cells,Tregs）比例改变。主要结果:1.免疫荧光结果显示,正常情况下,肠道少量表达HIF-1α,通过葡聚糖硫酸钠建立实验溃疡性结肠炎模型后,HIF-1α蛋白表达量明显上调;2.观察显示,DSS处理后,小鼠体重发生明显下降,尤其在第六天和第七天,结肠长度明显缩短,且相较于HIF-1α^+f/+f+DSS组,HIF-1α^IEC+DSS组小鼠体重下降更为明显,结肠缩短更为显著,疾病活动指数更高。同时,HE染色表明,肠炎条件下,结肠结构明显破坏,且HIF-1α^IEC+DSS组更为严重;qRT-PCR结果显示,肠炎条件下,IL-6、Lipocalin2、F4/80mRNA表达量明显上调,且敲除鼠上调更为明显;3.流式结果显示:正常条件下,HIF-1α^+f/+f组和HIF-1α^IEC组小鼠固有层Tregs细胞比例无明显差异;肠炎条件下,固有层Tregs细胞比例在CD3⁺细胞中明显上调,但HIF-1α^IEC+DSS组Tregs细胞比例上调受阻;qRT-PCR结果显示,肠炎条件下,肠上皮细胞IL-10,Aldh1a3表达上升,但敲除鼠Aldh1a3表达上调弱于对照组。4.流式结果显示:相较于对照组,HIF-1α^IEC小鼠肠上皮淋巴细胞亚群发生改变,CD8αβ⁺细胞比例增加,CD8αα⁺,TCRγδ⁺亚群细胞比例明显减少。此外,HIF-1α^IEC小鼠中,BrdU阳性CD8αα⁺细胞减少,提示较低增殖率;CD8αβ⁺和CD8αα⁺细胞凋亡率增加;CD103阳性CD8αα⁺细胞比例降低,提示较低细胞归巢和依附能力。DSS条件下,CD8αα⁺,TCRγδ⁺亚群细胞也少量减少。结论:1.生理条件下,HIF-1α在肠道少量表达,DSS处理后,HIF-1α被激活,表达量明显上调,提示肠道缺氧加重;2.肠上皮细胞HIF-1α特异性敲除可明显加剧DSS导致的结肠缩短,肠黏膜结构破坏,炎性因子分泌和炎症细胞浸润,提示上皮来源的HIF-1α在DSS诱导的结肠炎动物模型中发挥保护作用,HIF-1α可能成为干预炎症性肠病病理进展的新靶点;3.肠上皮细胞HIF-1α特异性敲除能够抑制DSS导致的固有层Tregs细胞比例上调,而Tregs在IBD中发挥着保护作用,提示HIF-1α发挥肠道保护作用可能通过Tregs间接产生作用;同时,HIF-1α可以影响肠上皮Aldh1a3表达,提示HIF-1α可能通过Aldh1a3调控Tregs的诱导;4.肠上皮细胞HIF-1α特异性敲除可以影响上皮间淋巴细胞的亚群构成,增殖凋亡能力,以及其表面的功能抗原,而上皮间淋巴细胞在维持肠屏障稳定性方面具有重要作用,提示上皮HIF-1α可能通过调节周围淋巴细胞缓解结肠炎性损伤及屏障破坏。