油菜根腐病的病原鉴定及Leptosphaeria biglobosa遗传多样性研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zwj10191021
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从甘肃省定西县发现一种油菜根腐病,罹病植株根表及周围土壤中含有黑色类似菌核的结构(称为菌核样结构)。为了弄清该病病原以及菌核样结构,本研究从发病油菜根部分离得到3株真菌,菌株号为LNO-2、P9和P10,对其进行了分类属性鉴定及生物学特性研究。此外,对油菜黑胫病病原Leptosphaeria biglobosa的遗传多样性开展了评估。取得的研究结果如下:1.明确了菌株LNO-2的分类地位及致病性克隆并测定了菌株LNO-2的ITS和LSU序列,比对分析显示:菌株LNO-2属于双核丝核菌(bineucleate Rhizoctonia)AG-H融合群。用DAPI染色技术观察菌株LNO-2菌丝细胞中的细胞核数量,进一步证实菌株LNO-2属于双核丝核菌。在油菜幼苗茎基部分别接种菌株LNO-2和多核丝核菌菌株Rs(对照)。菌株Rs造成油菜茎基部变黑,腐烂,而菌株LNO-2则不引起油菜茎基部发生任何病变。可见,菌株LNO-2对油菜没有致病性。2.明确了菌株P9和P10的分类地位及致病性克隆并测定了菌株P9和P10的ITS及LSU序列。用ITS和LSU序列单独以及合并构建系统发育树,结果进一步证实菌株P9和P10属于Leptosphaeria sclerotioides。在20℃下在PDA培养基上培养40 d后,菌株P9和P10在菌落表面着生分生孢子器,对分生孢子器切片观察,与Wunsch等(2011)描述的L.sclerotioides形态特征相符,进一步证明了菌株P9和P10属于L.sclerotioides。这是油菜上以及在我国首次发现L.sclerotioides。用油菜黑胫病菌菌株W10以及菌株P9和P10分生孢子悬浮液(1×10~7孢子/m L)分别刺伤接种油菜子叶、真叶和茎杆,考察其致病能力。结果显示:菌株W10接种的子叶、真叶和茎刺伤部位都出现坏死症状,而菌株P9和P10接种的油菜刺伤部位没有表现出坏死症状,说明菌株P9和P10对油菜没有致病力。3.明确了油菜上出现的菌核样结构的属性收集甘肃定西罹病油菜植株根围土壤及根表的菌核样结构,从中提取DNA。同时,从菌株P9和P10纯培养菌丝中提取DNA。利用L.sclerotioides特异性引物验证其序列是否相同。结果显示:从上述3种PCR反应中均扩增出了大小为499 bp 的DNA片段。由此证明:菌核样结构是L.sclerotioides产生的结构。切片结果显示:菌核样结构包含拟薄壁细胞构成的皮层和髓部,排列致密,最外层细胞黑褐色,没有发现疏丝组织。用小麦粒培养基培养菌株P9和P10,将其粉碎并接种于土壤中(每钵300 g),播种甘蓝型油菜(华油杂12),角果发育期,观察油菜根部发病情况。结果表明:接种P9和P10的油菜根部没有表现出病害症状。但是,在油菜根表及根围土壤中均出现了黑色菌核状结构。特异性PCR检测发现黑色菌核样结构是P9和P10产生的。这一结果证明L.sclerotioides可在油菜根围定植,菌核样结构可能是其产生的一种休眠结构。4.明确了菌株LNO-2的生防潜能在盆栽试验中研究了菌株LNO-2防治立枯丝核菌Rs的效果。将LNO-2的培养物与Rs培养物以1:1、1:2和1:3的比例混匀,拌土,播种油菜种子,记录出苗率。结果表明:LNO-2+Rs(1:1,1:2,1:3)处理的油菜出苗率均为0。说明菌株LNO-2不能有效抑制Rs引起的出苗前腐烂。为了探究其中的原因,设计了平板对峙试验和竞争试验。平板对峙试验证明菌株LNO-2对Rs没有拮抗作用。竞争试验证明:菌株LNO-2较Rs竞争性弱,与其菌丝生长较慢有关。5.发现菌株P9对油菜菌核病和油菜黑胫病有一定得防治效果设计了平板对峙试验、带毒平板试验以及防病试验,测定菌株P9对油菜菌核病菌(核盘菌)和油菜黑胫病菌的防治效果。平板对峙试验证实菌株P9对核盘菌和黑胫病菌有拮抗作用。带毒平板试验证实菌株P9代谢产物可以抑制核盘菌和黑胫病菌菌丝生长。防病试验显示菌株P9发酵物滤液能有效抑制核盘菌的侵染。6.L.biglobosa遗传多样性研究本文共筛选出4个具有多态性的SSR引物用于分析中国十个省的438个油菜黑胫病菌菌株的遗传多样性。通过遗传进化分析,江苏省的遗传多样性最高。各个省市的遗传多样性多样性由高到低的顺序为:江苏>湖南>四川>陕西>安徽>湖北>江西>上海>云南>河南。通过聚类分析,将438个菌株划分为3个群体。
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