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背景:心血管疾病(CVDs)是心脏和血管疾患引起的一组循环系统疾病,是目前全球人类死亡的首要原因,其发病率和死亡率一直呈上升趋势,已超过肿瘤性疾病而跃居第一,且其中一半以上发生在亚洲国家。CVDs发病率存在性别差异,即绝经后妇女CVDs的发病风险较同龄男性和绝经前妇女显著增加,这种差异与卵巢性激素对心血管系统的保护作用息息相关。健康妇女在围绝经期早期,内皮功能就开始下降,且其障碍程度与CVDs的发生发展密切相关。当血管内皮细胞发生功能障碍后,可表达免疫球蛋白超家族黏附分子(VCAM-1、ICAM-1等)、选择素家族成员(E-selectin、P-selectin等)以及分泌TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MIP、MCP-1等炎症介质,共同参与动脉粥样硬化发生、发展过程中的每个重要环节。研究表明,不论是自然绝经还是人为去势都可导致机体出现慢性炎症反应,并伴随血清IL-8、MCP-1、MIP-1α、RANTES升高。又有研究表明,绝经后妇女自主神经系统功能发生紊乱,表现为迷走神经活动降低、交感神经活动升高。而作为自主神经系统主要组成部分的迷走神经,可参与调控机体的炎症反应,并有学者将迷走神经及其递质乙酰胆碱(ACh)与免疫系统相互作用参与抗炎的神经-免疫调节通路命名为“胆碱能抗炎通路(CAP)”。我室前期研究也发现,迷走神经活动增加后可显著减轻结肠黏膜的炎症反应。故我们推测:绝经后妇女出现的血管内皮细胞激活和炎症反应可能与自主神经系统功能紊乱导致的免疫异常调节有关。研究表明,迷走神经传出纤维末梢释放的ACh可通过激活免疫细胞表面α7n ACh R,调控NF-κB/p65的核转位过程,抑制编码促炎细胞因子和趋化因子基因的转录。此外,MAPKs信号通路可直接或间接影响编码促炎细胞因子的基因转录过程,而IκB的磷酸化和NF-κB/p65的磷酸化、核转位被认为是其下游最重要的信号转导途径之一。我室前期研究结果发现,生物反馈可有效改善交感-迷走平衡,增强迷走神经活动、减弱交感神经活动。故我们提出假设:生物反馈可通过增强迷走神经活动调节自主神经内在平衡(迷走-交感平衡),在一定程度上激活CAP,进而减轻绝经后妇女血管内皮细胞的损伤、抑制炎性细胞因子的合成和释放并最终降低绝经后妇女CVDs的患病率和死亡率;而其内在机制则可能与n ACh R的激活和MAPKs、NF-κB信号通路的调控有关为验证上述科学假说,我们进行了动物实验和体外细胞实验。然而,由于生物反馈等认知行为疗法的顺利开展往往需要高级神经中枢的主动参与,其机制也相当复杂,依据目前的研究现状,我们尚不能在实验动物模型中完全模拟人体生物反馈训练的全过程。故我室王庭槐教授在前期研究的基础上,首次提出:增强迷走神经活动可部分模拟生物反馈过程中迷走神经活动增加的外周反应,并以此为切入点,开始在多种动物疾病模型中研究生物反馈增强迷走神经活动的外周机制。在本课题的研究中,我们通过切除雌性育龄期大鼠双侧卵巢来模拟女性绝经后状态,同时采用慢性迷走神经刺激来增加迷走神经活动,研究迷走神经活动增强对大鼠绝经去势模型的外周血管保护作用和抗炎效应,并结合体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)探讨其可能机制。目的:研究慢性迷走神经刺激对大鼠绝经去势模型外周血管内皮细胞损伤的保护作用和抗炎效应,并探讨n ACh R和MAPKs、NF-κB信号通路在其中的作用。第1章:慢性迷走神经刺激对去势大鼠血管内皮细胞损伤的影响及机制初探1.本部分实验对象为:7~8月育龄期SD雌性大鼠;具体分组如下:假手术组(sham-OVX)(n=9)、去势组(OVX)(n=10)、去势+假刺激组(OVX+sham-VNS)(n=10)和去势+刺激组(OVX+VNS)(n=9)。2.结合我室前期工作基础,在OVX和OVX+sham VNS组建立大鼠绝经去势模型;sham-OVX组也要接受去势手术,但不摘除卵巢;同时在OVX+sham-VNS和OVX+VNS组大鼠左侧颈部迷走神经干植入刺激电极,建立慢性迷走神经刺激(VNS)动物模型。OVX+VNS组每两天接受VNS干预一次,刺激参数为:连续单刺激,刺激频率20.0Hz,电流1.0m A,波宽10.0 ms,每次干预3h。OVX+sham-VNS组除不接受刺激外,其他处理同OVX+VNS组。3.于实验前后分别测量所有大鼠体重和血压水平;建立模型成功后正常饲养13周,每天记录体重变化情况;实验结束后,取大鼠血清、胸主动脉、心脏和子宫,观察大鼠一般情况的变化。4.HE染色后镜下观察大鼠胸主动脉内皮细胞的病理形态改变;透射电镜和扫描电镜观察大鼠胸主动脉内皮细胞超微结构的改变。5.离体血管环实验观察大鼠内皮细胞完整的胸主动脉舒张功能。6.采用可见分光光度法和酶联免疫吸附实验,检测大鼠胸主动脉血管内皮e-NOS表达、NO含量、血清ET-1和NO的水平以及主动脉管壁ACh的含量。第2章:慢性迷走神经刺激对去势大鼠炎症反应的调控作用1.本部分实验对象为:7~8月育龄期SD雌性大鼠和体外培养的HUVECs;动物实验分组如下:sham-OVX、OVX、OVX+sham-VNS和OVX+VNS;体外细胞实验采用100 ng/ml LPS与HUVECs共孵育8h,建立血管内皮细胞炎症模型。方法:2.采用免疫组织化学染色法检测大鼠胸主动脉内皮细胞黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表达。3.采用免疫印迹方法观察ACh(10-9~10-5M)预孵育24h后,对LPS诱导的HUVECs黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)表达的影响。4.采用酶联免疫吸附实验检测大鼠血清和HUVECs上清炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、CINC/KC、MCP-1)的水平。第3章:MAPKs、NF-κB信号通路在慢性迷走神经刺激减轻去势大鼠炎症反应中的作用及机制研究1.体外培养HUVECs,利用100 ng/ml LPS与HUVECs共孵育8h,建立血管内皮细胞炎症模型。2.采用免疫印迹方法分析α7n ACh R特异性阻断剂甲基牛扁碱(MLA)和n ACh R非特异性阻断剂美加明(mec)对ACh降低LPS诱导的黏附分子表达的影响。3.采用免疫组织化学染色法和免疫印迹方法,观察血管壁NF-κB/p65的表达和核转位。4.采用免疫印迹方法检测HUVECs NF-κB/p65、p-NF-κB/p65、IκB、p-IκB、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白分子的表达。结果:第1章:慢性迷走神经刺激对去势大鼠血管内皮细胞损伤的影响及机制初探1.大鼠切除卵巢13周后:扫描电镜结果显示,血管内膜出现明显的损伤,表现为血管内皮细胞的萎缩、变形、脱落以及大量纤维蛋白黏附至内皮表面;透射电镜结果显示,血管内皮细胞和平滑肌细胞均出现不同程度的损伤,表现为内皮细胞肿胀、线粒体肿胀、胞质液化,以及内皮细胞坏死,内弹力膜厚薄不均、断裂等;而去势大鼠接受慢性VNS干预后可显著减轻血管内皮细胞的损伤。提示:慢性迷走神经刺激可显著改善去势大鼠血管内皮细胞超微结构的异常改变。2.与去势大鼠相比,OVX+VNS组大鼠胸主动脉环对ACh(10-9~10-5 M)诱导的血管内皮细胞最大舒张率显著增加,接近正常对照组。提示:慢性迷走神经刺激可显著改善去势大鼠血管内皮依赖性舒张功能障碍。3.与去势大鼠相比,OVX+VNS组大鼠血管壁内皮e-NOS表达、NO含量显著增加,血清ET-1的水平显著降低,接近正常对照组;且OVX+VNS组大鼠血管壁ACh含量较sham-OVX、OVX、OVX+sham-VNS组显著增加。提示:慢性迷走神经刺激减弱去势大鼠内皮细胞损伤、改善血管内皮细胞功能障碍的机制可能与血管壁内皮e-NOS表达升高、NO产生增多、血清ET-1的水平降低有关,且该效应可能与迷走神经活动增强后外周释放的ACh增多有关。第2章:慢性迷走神经刺激对去势大鼠炎症反应的调控作用1.与去势大鼠相比,OVX+VNS组大鼠血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表达降低,接近正常对照组。2.与去势大鼠相比,OVX+VNS组大鼠血清炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1)的水平显著降低,接近正常对照组。3.在体外培养的HUVECs中,ACh(10-9~10-5 M)可浓度依赖性降低LPS诱导的黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表达;其中以10-6和10-5 M ACh的效果最为明显。4.在体外培养的HUVECs中,ACh(10-9~10-5 M)可浓度依赖性降低LPS诱导的炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1)的释放;其中也以10-6和10-5 M ACh的效果最为明显。1.特异性阻断α7n ACh R受体,不能阻断ACh降低LPS诱导的内皮细胞黏附分子(VCAM-1)表达的效应;而非特异性阻断n ACh R可显著阻断ACh降低LPS诱导的内皮细胞黏附分子(VCAM-1)表达的效应。2.与正常对照组相比,去势大鼠血管壁NF-κB/p65的表达显著增多、NF-κB/p65亚基的核转位现象也较明显;而接受慢性VNS干预的大鼠,血管壁NF-κB/p65的表达量和核转位恢复正常,接近正常对照组。3.在体外培养的HUVECs中,ACh(10-6 M)可显著降低LPS诱导的NF-κB/p65、IκB、ERK、JNK、p38MAPK蛋白分子的磷酸化。第3章:MAPKs、NF-κB信号通路在慢性迷走神经刺激减轻去势大鼠炎症反应中的作用及机制研究结论:1.慢性迷走神经刺激可显著减轻去势大鼠血管内皮细胞的损伤、改善血管内皮细胞的功能障碍;其机制可能与迷走神经活动增强后,血管局部乙酰胆碱释放增加引起的血管内皮e-NOS表达和NO含量增多、血清ET-1水平下降有关。2.慢性迷走神经刺激可显著减轻去势大鼠血管内皮黏附分子(VCAM-1、ICAM-1、E-selectin)的表达和血清炎性细胞因子(TNF-α、IL-6、CINC/KC、MCP-1)的水平。提示:慢性迷走神经刺激可减轻去势大鼠的血管内皮炎症反应,其机制可能与迷走神经活动增强后血管局部乙酰胆碱释放增加,进而抑制血管内皮细胞的激活有关。3.MAPKs(ERK、JNK、p38MAPK)、NF-κB信号通路共同参与慢性迷走神经刺激减轻去势大鼠血管内皮炎症反应的作用,且该过程可能由n ACh R所介导。