糖尿病微血管病变是糖尿病多种并发症的病理学基础,其分布广泛,是糖尿病患者致死致残的主要原因之一。其中内皮屏障功能受损导致的血管通透性增高和内皮激活状态下的血管新生是糖尿病微血管病变的重要病理特征。探讨糖尿病引起血管通透性增高和异常血管新生的机制也是多年来糖尿病微血管并发症的研究热点。晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)是蛋白质、脂质或核酸等大分子与还原糖之间进行无酶糖基化反应而形成的不可逆的共价加成物。糖尿病患者体内的高血糖和氧化应激状态可加速AGEs的形成,造成AGEs的异常累积。研究表明,AGEs与其受体(receptor of advanced glycation end products,RAGE)的结合,经一系列信号通路介导细胞粘附连接结构破坏及细胞骨架蛋白重塑,使细胞间的粘附力和细胞的向心收缩力失衡,最终导致细胞通透性增高。此外,研究还发现AGEs可促进人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、成管,介导血管新生。尽管有许多研究旨在揭示AGEs介导血管通透性增高和血管新生的机制,但AGEs是如何介导细胞粘附连接结构破坏和骨架蛋白重构以及AGEs介导血管新生的具体机制尚有待进一步探究。β-catenin是一个同时具有作为结构分子和信号转导双重功能的蛋白质。细胞中的β-catenin主要作为粘附连接的成员之一被锚定于细胞膜上,胞浆中游离的β-catenin则会被其降解复合物迅速识别并降解。但在胞外Wnt信号存在时,细胞内β-catenin降解复合物的功能受到抑制,使β-catenin得以稳定存在于细胞浆中,在B细胞淋巴瘤因子-9(BCL-9)等分子的协助下,β-catenin移位入核与核内转录因子TCF/LEF结合启动下游Wnt相关基因的表达。在粘附连接结构中β-catenin的一端与cadherin的胞内段结合,保护cadherin不被泛素化降解,从而稳定细胞间的粘附连接。另一端与α-catenin结合,阻止α-catenin致肌动蛋白纤维重组的功能,间接参与细胞骨架蛋白重构。研究发现上皮细胞中β-catenin Y654磷酸化可削弱E-cadherin与β-catenin的亲和力从而削弱细胞间的粘附连接。本课题组前期实验结果显示AGEs可破坏血管内皮细胞间连接结构,介导屏障功能受损和血管通透性增加,但β-catenin在其中的作用还有待探讨。另外,β-catenin Y142磷酸化可阻止其与α-catenin的结合,并可促进β-catenin移位入核,介导血管内皮细胞生长因子等Wnt相关基因的表达。研究发现AGEs可通过与受体RAGE结合介导VEGF表达,这也提示我们,β-catenin可能参与了 AGEs介导血管新生的过程。目的:本研究以β-catenin为中心,探讨β-catenin磷酸化在AGEs介导的内皮细胞通透性增高以及血管新生中的作用。方法:在细胞水平上,以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)为研究对象,以AGEs为刺激物,用免疫共沉淀技术和激光共聚焦显微镜观察粘附连接蛋白的解离情况;分别提取胞浆蛋白、核蛋白检测β-catenin的移位入核;用荧光漏出法和跨细胞电阻(Transendothelial Electrical Resistance,TER)检测内皮细胞单层的通透性和屏障功能;用细胞计数试剂盒(cell counting Kit-8,CCK-8)检测内皮细胞的增殖能力;细胞划痕及Transwell实验检测内皮细胞的迁移能力;Matrigel实验检测内皮细胞的成管能力。分别用用Src特异性抑制剂PP2、Src siRNA以及Src野生型、激活型和失活型过表达质粒探究AGEs是否通过Src介导β-catenin Y654磷酸化。用附着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)抑制剂探究 AGEs 是否通过其介导β-catenin Y142磷酸化。分别构建β-catenin Y654失活型、激活型以及β-catenin Y142失活型、激活型过表达质粒,探究AGEs是否通过β-catenin磷酸化介导其生物学效应。在动物水平,分别用这两种过表达腺病毒探究β-catenin磷酸化在AGEs介导的小鼠肠系膜通透性增高中的作用。结果:一、β-catenin在AGEs介导的血管通透性增高中的作用。1.AGEs介导粘附连接结构解离、应力纤维形成,从而导致内皮细胞通透性增高。以HUVECs为研究对象,免疫共沉淀实验和免疫荧光法检测细胞粘附连接蛋白和其结构的解离情况。结果显示,AGEs刺激 1 h 后VE-cadherin/β-catenin/α-catenin的结合减少。同时激光共聚焦显微镜观察到AGEs 刺激 12 h 后 VE-cadherin/β-catenin 以及 β-catenin/α-catenin 的共定位减少。表明AGEs引起内皮细胞粘附连接结构解离;用免疫荧光染色F-actin检测细胞内应力纤维的形成。结果显示AGEs刺激12 h后,原本处于细胞周边的肌动蛋白纤维发生重组,形成丝状的应力纤维束,表明AGEs介导应力纤维的形成。荧光漏出法和TER法检测的结果显示,AGEs作用于HUVECs 8 h和12 h时,TER值降低,同时FITC-dextran漏出增多,表明AGEs介导HUVECs屏障功能的障碍和通透性增加。2.β-catenin Y654磷酸化参与AGEs介导的内皮细胞通透性增高以HUVECs为研究对象,探究AGEs引起β-catenin Y654磷酸化的时间效应和浓度效应。结果显示,在AGEs刺激10 min即可引起β-catenin Y654磷酸化,在60 min时达到顶峰,120 min时恢复到正常水平。用不同浓度AGEs刺激HUVECs,结果显示,在AGEs浓度为100 μg/mL～200 μg/mL时可引起β-catenin Y654 磷酸化。分别用Src特异性抑制剂PP2、Src siRNA、Src过表达质粒预处理HUVECs,再用AGEs刺激60 min,检测β-catenin Y654磷酸化。结果显示,PP2、Src siRNA、Src失活型质粒转染可抑制AGEs介导的β-catenin Y654磷酸化。Src激活型质粒和Src野生型质粒则激活β-catenin Y654磷酸化。表明AGEs通过Src介导β-catenin Y654磷酸化。分别用β-catenin Y654激活型、失活型突变质粒预处理细胞,用AGEs刺激相应时间,再分别检测VE-cadherin/β-catenin的解离情况以及细胞的通透性的变化。免疫共沉淀和免疫荧光结果显示,细胞过表达Y654失活型β-catenin(Y654F)可阻断 AGEs 引起的 VE-cadherin/β-catenin 的解离。TER 和荧光渗漏实验结果显示阻断β-catenin Y654磷酸化可减轻AGEs引起的内皮细胞通透性增高。上述实验结果表明,AGEs通过β-catenin Y654磷酸化介导细胞粘附连接结构的破坏而引起细胞通透性增高。3.β-catenin Y142磷酸化参与AGEs介导的内皮细胞通透性增高以HUVECs为研究对象,用AGEs刺激60 min,WB检测β-catenin Y142磷酸化。结果显示,AGEs组β-catenin Y142磷酸化水平增加。表明AGEs介导 β-catenin Y142 磷酸化。用FAK抑制剂PF573228预处理细胞,再用AGEs刺激60 min,WB检测β-catenin Y142磷酸化。结果显示,PF573228可抑制AGEs介导的β-catenin Y142磷酸化。表明AGEs通过FAK介导β-catenin Y142磷酸化。分别用β-catenin Y142激活型、失活型突变质粒预处理细胞,用AGEs刺激相应时间,再分别检测细胞β-catenin/α-catenin的解离情况、应力纤维的形成以及细胞的通透性大小。免疫荧光结果显示:细胞过表达Y654F阻断AGEs介导的β-catenin/α-catenin的解离以及应力纤维的形成。TER和荧光渗漏实验结果显示阻断β-catenin Y142磷酸化减轻AGEs引起的内皮细胞通透性增高。4.β-catenin Y654、Y142磷酸化参与AGEs介导的小鼠肠系膜血管通透性增高利用腺病毒使小鼠肠系膜组织过表达Y654、Y142位点失活型β-catenin(Y654F、Y142F),再用AGEs连续7天进行腹腔注射,最后检测小鼠肠系膜血管对荧光蛋白FITC-dextran的通透性。结果显示,Y654F、Y142F均能减轻AGEs介导的血管细胞通透性增高。动物水平上验证了β-catenin Y654、Y142磷酸化参与AGEs介导的小鼠肠系膜血管通透性增高。二、β-catenin在AGEs介导的血管新生中的作用1.β-catenin Y142 磷酸化促进 β-catenin 入核AGEs刺激HUVECs相应时间,分别取胞浆蛋白核蛋白,WB检测β-catenin以探究其是否发生移位入核。结果显示,AGEs作用60 min后,胞浆中的β-catenin减少,而胞核内β-catenin增加,且随着刺激时间增加,这种变化更为明显。表明AGEs以时间依赖的方式介导β-catenin移位入核。用Y142F过表达质粒预处理细胞,再用AGEs刺激2 h,分别提取胞浆蛋白和核蛋白,WB检测β-catenin。结果显示,Y142F+AGEs组胞浆内β-catenin增多,而胞核中β-catenin减少,表明阻断β-catenin Y142磷酸化可抑制β-catenin移位入核。2.β-catenin Y142磷酸化参与AGEs介导的内皮细胞增殖、迁移和成管用Y142F质粒预处理HUVECs,48 h后用AGEs刺激24 h,分别检测细胞的增殖、迁移和成管能力。结果显示,过表达Y142F可抑制AGEs介导的内皮细胞增殖,减少划痕后的迁移面积和Transwell中细胞的迁移个数,减少Matrigel中的血管分支节点和血管总长度。结果表明阻断β-catenin Y142磷酸化可抑制AGEs介导的内皮细胞增殖、迁移、成管。在抑制剂组中,用Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG-001预处理HUVECs 24 h后,用AGEs刺激,再分别检测细胞的增殖、迁移、成管。结果显示,ICG-001可抑制AGEs介导的内皮细胞增殖、迁移、成管。表明AGEs介导β-catenin入核后,促进内皮细胞增殖、迁移、成管。上述结果表明,AGEs介导β-catenin Y142磷酸化,促进其入核而介导血管新生。结论:1.AGEs 通过 Src 介导 β-catenin Y654 磷酸化,进而介导VE-cadherin/β-catenin解离,破坏细胞间粘附连接结构,削弱细胞间粘附力,从而使内皮细胞通透性增高。2.AGEs 通过 FAK 介导 β-catenin Y142磷酸化,从而破坏β-catenin/α-catenin的结合,游离的α-catenin促进细胞骨架蛋白重构,形成应力纤维,增加细胞的收缩力,使内皮细胞通透性增高。3.β-catenin磷酸化使其从粘附连接结构中脱落。而β-catenin Y142磷酸化促进胞浆中游离的β-catenin移位入核,从而参与AGEs介导的血管新生的过程。