论文部分内容阅读
本实验原代分离培养小鼠肝脏Kupffer细胞,采用特异性烟碱型乙酰胆碱受体激动剂——烟碱,观察胆碱能性抗炎通路激活后对小鼠肝脏Kupffer细胞的影响,并以生存率为指标,评估烟碱对肝脏Kupffer细胞的影响及全身炎症反应的治疗作用。第一部分,采用密度梯度离心的方法原代分离培养小鼠肝脏Kupffer细胞,经苔盼蓝染色和流氏细胞仪对细胞活性和纯度进行鉴定;第二部分,采用荧光共聚焦显微镜和Western的方法,检测小鼠肝脏Kupffer细胞中是否存在α7-乙酰胆碱受体(α7-ACh受体);第三部分,采用Elisa方法,测定给予LPS后,原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞上清液和BALB/c小鼠血清中TNF-α、IL-10和HMGB-1的浓度变化;第四部分,将100只BALB/c小鼠(6-8周,雄性)随机分为四组(LPS组、LPS+Nic组、LPS+Nic+GdCl3组和LPS+Nic+左侧迷走神经切断组),给予致死量的LPS 15mg/kg,观察72小时内动物死亡率的变化。本实验结果证实,小鼠肝脏Kupffer细胞中存在α7-ACh受体,并探讨了小鼠肝脏Kupffer细胞在胆碱能性抗炎通路中的作用。【目的】原代分离培养小鼠肝脏Kupffer细胞,并鉴定其活性和纯度;判断原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞中是否存在α7-ACh受体;研究烟碱对小鼠肝脏Kupffer细胞上清液及小鼠血清中炎症因子释放的影响;研究烟碱对内毒素血症小鼠死亡率的影响及肝脏Kupffer细胞在其中所起的作用。【方法】(1)每次取3-5只BALB/c小鼠(6-8周,重约16-18g,雄性),采用IV型胶原酶消化、Percoll密度梯度离心的方法分离培养肝脏Kupffer细胞,经苔盼蓝染色和流式细胞仪检测细胞活性和纯度。(2)采用荧光共聚焦显微镜和Western的方法,鉴定原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞中α7-ACh受体的存在。(3)将小鼠肝脏Kupffer细胞分为七组(100nM LPS、100nM LPS +0.01mM Nic、100nM LPS +0.01mM Nic+1μMα-BGT、100nM LPS +0.1mM Nic、100nM LPS +0.1mM Nic+1μMα-BGT、100nM LPS +1mM Nic、100nM LPS +1mM Nic+1μMα-BGT);将小鼠随机分为六组(LPS组、LPS+左侧迷走神经切断组、LPS+Nic组、LPS+Nic组+左侧迷走神经切断组、LPS+Nic+GdCl3组、LPS+Nic+GdCl3+左侧迷走神经切断组)。分别在给予Nic 4h、12h和24h后,取小鼠肝脏Kupffer细胞培养上清液和小鼠心脏穿刺取血并离心后的血清,采用Elisa法分别测定TNF-α、IL-10和HMGB-1的浓度变化。(4)将100只BALB/c小鼠(6-8周,雄性)随机分为四组(LPS组、LPS+Nic组、LPS+GdCl3组和LPS+Nic+左侧迷走神经切断组),腹腔注射致死剂量的LPS15mg/kg后,每12h观察一次,记录72小时内动物死亡率。【结果】(1)原代分离培养小鼠肝脏Kupffer细胞,活性和纯度均达80%-90%,符合实验要求;(2)用FITC-αBGT标记原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞后,荧光共聚焦显微镜下可以观察到细胞膜上存在α7-ACh受体,Western结果亦证实了α7-ACh受体蛋白的表达; (3)就Kupffer细胞培养上清液而言,与单纯LPS组比较,a)给予Nic后4h,TNF-α浓度降低,降低程度与Nic浓度呈剂量相关性。加入α-BGT后,TNF-α浓度变化与LPS组相比无明显差异;b)给予Nic后12h, IL-10浓度升高,升高程度与Nic浓度呈剂量相关性。加入α-BGT后,IL-10浓度变化与LPS组相比无明显差异;c)给予Nic后24h, HMGB-1浓度降低,降低程度与Nic浓度呈剂量相关性。加入α-BGT后,HMGB-1浓度变化与LPS组相比无明显差异。就小鼠血浆而言,与单纯LPS组比较,a)给予Nic后4h,TNF-α浓度在LPS+左侧迷走神经切断组升高,在LPS+Nic组、LPS+Nic +左侧迷走神经切断组、LPS+Nic+ GdCl3组及LPS+ Nic+ GdCl3+左侧迷走神经切断组均降低;b)给予Nic后12h, IL-10浓度在LPS+左侧迷走神经切断组降低,在LPS+Nic组、LPS+Nic +左侧迷走神经切断组、LPS+Nic+ GdCl3组及LPS+Nic+ GdCl3+左侧迷走神经切断组均升高;c)给予Nic后24h,HMGB-1浓度在LPS+左侧迷走神经切断组升高,在LPS+Nic组、LPS+Nic +左侧迷走神经切断组、LPS+Nic+ GdCl3组及LPS+Nic+ GdCl3+左侧迷走神经切断组均降低;(4)与LPS组比较,LPS+Nic组死亡率显著降低,LPS+GdCl3组和LPS+Nic+左侧迷走神经切断组死亡率亦降低,但高于LPS+Nic组。【结论】IV型胶原酶消化、Percoll密度梯度离心法原代分离培养的肝脏Kupffer细胞,活性和纯度符合实验要求,是后续实验α7-ACh受体鉴定的基础。荧光共聚焦显微镜和Western结果均证实,原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞中存在α7-ACh受体。烟碱可以抑制Kupffer细胞和小鼠血清中早期炎症因子TNF-α、晚期炎症因子HMGB-1的释放,促进抑炎因子IL-10的释放,并呈剂量相关性;切断左侧颈部迷走神经或给予GdCl3,均使烟碱的抗炎作用减弱。烟碱能降低内毒素血症小鼠死亡率,该作用可以部分被左侧迷走神经切断或GdCl3拮抗。