一、研究背景随着我国海洋事业的大力发展,海军建设不断迈向深蓝,海水溺水事故也不断引起人们的关注和重视。海水淹溺诱导的急性肺损伤（Seawater drowning-induced acute lung injury,SWD-ALI）是因海水吸入引起的气体交换屏障受损,导致大量液体渗出至肺泡间质、肺泡腔,并快速堆积形成急性肺水肿,甚至可能发展成为急性呼吸窘迫综合征。从分子机制入手研究海水淹溺诱导的急性肺损伤,可以为相关药物研发、临床伤者救治提供理论依据。铁死亡是一种新形式的程序性细胞死亡（Programmed cell death,PCD）,其特点是铁积累过多,随后出现不平衡的氧化还原状态。铁死亡与已经报道的PCD不同,具有独特的形态学特征和生化过程。铁死亡过程受到铁代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等众多信号通路的精确调节,参与多种疾病的发生发展过程。最近的研究发现,铁死亡与急性肺损伤的发生和发展密切相关,包括感染相关急性肺损伤、辐射相关急性肺损伤、缺血再灌注引起的急性肺损伤、海水淹溺诱导的急性肺损伤等。Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）是一种真核生物转录因子,已被发现可调节多种细胞过程、参与多种疾病的发生发展;研究表明,KLF4在急性肺损伤中能够发挥保护作用,提高KLF4表达可以改善小鼠LPS诱导的急性肺损伤的病理状态和炎症反应。近期研究发现,KLF4可以在蛋白水平上调SLC7A11,从而调控铁死亡。那么,表达上调KLF4是否对SWD-ALI有保护作用?其影响是否与KLF4对铁死亡的调控有关?二、研究目的（一）构建海水淹溺诱导的急性肺损伤C57BL/6小鼠模型,并初步探究其与铁死亡的相关性;（二）探究转录因子KLF4对海水刺激诱导的BEAS-2B细胞铁死亡的影响;（三）探究KLF4上调对小鼠海水淹溺诱导急性肺损伤中铁死亡的影响及对小鼠肺损伤的影响。三、研究方法（一）小鼠海水淹溺诱导的急性肺损伤模型建立及铁死亡初步探究通过气管插管滴注海水的形式构建小鼠SWD-ALI模型,通过血气分析,肺湿/干质量比,肺损伤评分,肺泡灌洗液炎症因子、蛋白总量、细胞总数等评价模型构建成功与否。测定肺组织ROS含量、MDA含量、GSH含量,以及铁死亡相关蛋白含量,判断该模型的肺损伤是否发生铁死亡。（二）转录因子KLF4对海水刺激诱导BEAS-2B细胞铁死亡的作用研究使用UCSC结合JASPAR预测SLC7A11可能的转录因子,通过与前期转录本测序中高表达基因对比,筛选出KLF4可能通过调控SLC7A11在海水刺激诱导BEAS-2b细胞铁死亡中发挥作用;通过si RNA转染和质粒DNA转染分别上调和下调KLF4在BEAS-2B细胞的表达;采用蛋白质印迹法观察KLF4和铁死亡相关蛋白SLC7A11和GPX4表达情况,检测细胞死亡率和ROS含量、MDA含量、GSH含量,探究转录因子KLF4对海水刺激诱导的BEAS-2B细胞铁死亡的作用。（三）KLF4对小鼠海水淹溺诱导的急性肺损伤中铁死亡的作用研究使用KLF4激动剂APTO-253上调小鼠KLF4表达,采用蛋白质印迹法观察肺组织KLF4的表达水平,以及GPX4和SLC7A11表达情况。检测肺组织ROS含量、MDA含量、GSH含量,探究KLF4上调对小鼠SWD-ALI中铁死亡的影响;通过血气分析,肺湿/干质量比,肺损伤评分,探究KLF4上调对小鼠肺损伤情况的影响。四、研究结果（一）小鼠海水淹溺性急性肺损伤模型建立及铁死亡初步探究经口气管插管注射海水的方式能够成功构建SWD-ALI模型,实验组与对照组相比,肺部大体外观损伤明显,肺损伤评分显著升高,肺湿/干质量比增加,出现酸中毒和以低氧血症、高碳酸血症为特点的II型呼吸衰竭,氧合指数显著下降,符合急性肺损伤甚至急性呼吸窘迫综合征的标准;BALF蛋白总量升高、细胞总数增加,各炎症因子水平均有不同程度的升高。上述病理生理变化均具有时间依赖性,海水吸入后相关指标逐渐偏离正常值,在吸入后6小时左右达到极值,随后回归正常水平。海水淹溺组小鼠肺组织GSH含量降低、ROS和MDA含量升高,且该变化能够被铁死亡抑制剂逆转,铁死亡相关基因特征性表达,提示铁死亡与海水淹溺性肺损伤的关联性。（二）转录因子KLF4对海水刺激诱导BEAS-2B细胞铁死亡的作用研究我们通过UCSC网站查找SLC7A11上游的2000个碱基序列,并通过JASPAR网站生信分析预测可能靶向SLC7A11启动子区域的转录因子,最后通过与前期海水淹溺性肺损伤细胞模型的转录本测序结果进行比较,在海水刺激组高表达的差异基因中筛选出KLF4。si RNA转染后KLF4沉默的BEAS-2B细胞在应对海水刺激时,展现出更弱的抵抗力:与单纯海水刺激组相比,细胞死亡率更高,ROS含量更高,MDA堆积更严重,GSH消耗更严重,同时SLC7A11和GPX4的表达更低。质粒DNA转染后的KLF4高表达BEAS-2B细胞在应对海水刺激时,展现出很强的抵抗力,与单纯海水刺激组相比,细胞死亡率明显降低、ROS和MDA含量减少、GSH含量升高,同时SLC7A11和GPX4的表达增加。以上研究表明,转录因子KLF4确实可以调节海水刺激诱导的BEAS-2B细胞铁死亡,在海水刺激引起的BEAS-2B细胞急性损伤中起到保护作用,这一点可能是通过靶向调控SLC7A11而实现的。（三）KLF4对小鼠海水淹溺诱导的急性肺损伤中铁死亡的作用研究相较对照组,海水淹溺组小鼠KLF4表达增加,SLC7A11和GPX4表达减少;海水淹溺+APTO-253处理组相较海水淹溺组,肺组织SLC7A11和GPX4表达增加,肺组织中ROS含量减少、MDA含量减少、GSH含量增加;同时,肺损伤评分下降、肺湿/干质量比减小、Pa O2升高、Pa CO2下降、p H升高、氧合指数升高。至此,以在体水平证明KLF4上调可以抑制SWD-ALI小鼠铁死亡,发挥对肺损伤的保护作用。五、研究结论（一）KLF4对海水刺激诱导的BEAS-2B细胞铁死亡有调控作用,KLF4的表达与铁死亡呈负相关;这一点可能是因为KLF4对SLC7A11的调控起作用;（二）KLF4上调能够抑制小鼠海水淹溺诱导急性肺损伤中铁死亡的发生,对小鼠肺损伤发挥保护作用。