牙髓和牙周韧带组织再生修复是构建组织工程生物牙根的关键，其目标是重建具有生物学活性和功能的组织。人牙髓细胞(dental pulp cells，DPCs)和牙周韧带细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是构建生物牙根的种子细胞，具有克隆形成、自我更新和多向分化能力。由于牙髓和牙周韧带组织来源和生物学功能不尽相同，DPCs和PDLCs性能各异。比较研究DPCs和PDLCs体外培养和诱导矿化的基因表达，对口腔组织工程提供可靠的种子细胞来源有重要意义。细胞培养微环境与细胞多能性维持有紧密关系。长期体外培养可使细胞增殖和分化能力进行性下降。应激状态可激活相关信号通路，促使体细胞去分化，行使修复功能，改变培养条件和微环境可能诱导细胞出现去分化。如何使静止期的细胞重新进入细胞周期，由已分化状态去分化为未分化状态，从而改变细胞性状，尚需进一步研究。牙髓牙本质复合体和牙周附着装置修复再生是复杂的生物过程，涉及细胞增殖、迁移、分化、修复性组织形成等，受Notch、Wnt、TGF-β/BMP及Cadherin等信号网络调控。目前，关于DPCs和PDLCs体外诱导分化和组织再生的调控机制尚不清楚，对人牙源性细胞分化的分子标记和调控信号研究将有助于阐明牙组织修复再生机制。　　 本研究采用实时荧光定量RT-PCR芯片等方法检测DPCs和PDLCs体外连续培养过程中干细胞相关基因Sox2、Oct-4和c-Myc的表达变化，揭示细胞多能性维持和细胞老化的调控机制，为进一步探索体外培养细胞多能性维持的方法提供新思路；比较DPCs和PDLCs体外成牙本质/成骨分化的能力及差异表达基因变化，揭示成牙本质/成骨分化的信号调控机制，对利用DPCs和PDLCs进行临床治疗有积极意义。本研究分为两个部分：　　 第一章：干细胞相关基因在体外培养的牙髓和牙周韧带-细胞的表达。　　 目的：检测DPCs和PDLCs体外培养过程干细胞相关基因Sox2、Oct-4和c-Myc的表达，探讨体外连续培养对干细胞性能的影响，揭示干细胞相关基因对体外培养牙源性细胞多能性的调控机制。　　 方法：取成人健康阻生第三磨牙或正畸拔除双尖牙的牙髓和牙周韧带组织，免疫荧光染色检测体外培养组织Sox2、Oct-4和c-Myc的表达，未经体外培养的组织为对照组。组织块接种法培养DPCs和PDLCs，取第0、2和7代细胞，免疫荧光染色和实时定量荧光RT-PCR检测Sox2、Oct-4和c-Myc表达，统计学分析。　　 结果：免疫荧光显示Sox2、Oct-4和c-Myc在体外培养4w的组织呈阳性表达，对照组无表达。Sox2、Oct-4和c-Myc荧光表达随传代由细胞核转移到细胞浆，第0和第2代间细胞核阳性率差异无统计学意义(p＞0.05)，第7代细胞核阳性率显著降低(p＜0.05)。实时定量荧光RT-PCR显示Sox2和Oct-4 mRNA在DPCs和PDLCs体外传代培养中呈相似的表达模式，随DPCs和PDLCs传代先上升后下降(p＜0.05)；c-Myc mRNA随DPCs传代先上升后下降，而随PDLCs传代持续上调(p＜0.05)。　　 结论：细胞体外培养微环境可激活DPCs和PDLCs中干细胞相关基因表达，DPCs和PDLCs体外培养过程可能存在自发去分化。扩增早期的DPCs和PDLCs中Sox2、Oct-4和c-Myc表达水平较高，是应用于口腔再生医学的理想模型。Sox2和Oct-4在牙源性细胞体外连续培养中呈相似的表达模式，可能对细胞多能性维持存在协同调控作用。　　 第二章：牙髓和牙周韧带细胞的矿化能力比较研究。　　 目的：诱导矿化DPCs和PDLCs，检测和比较DPCs和PDLCs矿化能力，为阐明两种细胞矿化过程的信号调控机制提供实验依据。　　 方法：酶消化法培养DPCs和PDLCs，取第3代细胞培养于成牙本质/成骨诱导培养基。Von Kossa染色，ImageJ软件图象分析。取矿化诱导0、7、14和21d的细胞，检测ALP和钙离子活性变化，统计学分析。　　 结果：矿化诱导14d，DPCs和PDLCs分泌矿化基质，Von Kossa染色显示矿化结节形成，ImageJ结果示两者矿化结节数量差异无统计学意义(p＞0.05)，PDLCs矿化结节面积显著大于DPCs(p＜0.05)。矿化诱导7、14和21d，PDLCs的钙离子活性均显著高于DPCs(p＜0.05)；矿化诱导14d，PDLCs的ALP活性显著高于DPCs(p＜0.05)，其余时间点两者ALP活性差异无统计学意义(p＞0.05)。　　 结论：酶消化法分离培养的DPCs和PDLCs经诱导可向成牙本质/成骨样细胞分化，PDLCs的矿化结节面积、ALP活性和钙离子活性均显著高于DPCs，提示体外培养的PDLCs矿化能力强于DPCs。　　 第三章：牙髓和牙周韧带细胞向成牙本质/成骨样细胞分化的基因表达研究。　　 目的：检测和比较DPCs和PDLCs向成牙本质/成骨样细胞分化的差异表达基因，寻找DPCs和PDLCs分化的分子标记，揭示DPCs和PDLCs分化及组织再生的调控机制。　　 方法：取第3代DPCs和PDLCs矿化诱导14d，实时荧光定量RT-PCR芯片检测诱导前后差异表达基因，数据分析并筛选表达差异大于3倍的基因；建立大鼠牙髓牙周联合损伤修复模型，免疫荧光染色验证部分差异表达基因。　　 结果：矿化诱导后，DPCs和PDLCs分别有差异表达基因7和16个，其中DPCs5个基因上调，2个基因下调；PDLCs5个基因上调，11个基因下调。细胞处于未分化状态时，PDLCs中6个基因表达显著高于DPCs，4个基因表达显著低于DPCs；矿化诱导后，PDLCs中4个基因表达显著高于DPCs，10个基因表达显著低于DPCs。DPCs和PDLCs矿化过程涉及Notch、Wnt、TGF-β/BMP及Cadherin等信号通路(APC、DLL1、CCND2、BMP2和CDH1)。免疫荧光染色检测BMP2和CDH1在大鼠牙髓牙周联合损伤修复中的表达，与实时荧光定量RT-PCR芯片结果一致。　　 结论：获得DPCs和PDLCs向成牙本质/成骨分化的差异表达基因，揭示Notch、Wnt、TGF-β/BMP及Cadherin等信号通路参与调控DPCs和PDLCs向成牙本质/成骨分化以及牙组织损伤修复。