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鸡软骨富含胶原蛋白和硫酸软骨素,具有良好的骨健康保护功效。本文以鸡肉加工副产物鸡软骨为原料,采用不同的酶解工艺制备鸡软骨酶解物;通过特性分析和活性评价,选用最优鸡软骨酶解物进行分离纯化和结构解析,获得有明确氨基酸序列的小肽;考察鸡软骨活性肽对MC3T3-E1增殖、分化和凋亡的影响,并研究其逆转MC3T3-E1细胞凋亡损伤的作用机制。本实验采用单因素优化实验考察不同蛋白酶、酶底比、pH、温度和时间对鸡软骨粉末酶解的影响。结果表明,采用0.50%碱性蛋白酶、pH7.0、55°C和9 h进行酶解可获得最优鸡软骨酶解物,其蛋白质回收率为57.00%,水解度为26.53%,小分子肽（<1kDa）占比为61.62%,DPPH·清除IC50值为5.14 mg/mL,ORAC值为0.57μmol TE/mg peptides。皮尔逊相关性分析结果表明,酶解物的水解度和分子量分布（<1 kDa）分别与其ORAC活性具有显著的相关性,相关系数r分别为0.737和0.534。采用DEAE-52阴离子交换色谱法和凝胶排阻色谱法对最优鸡软骨酶解物进行分离纯化,最终获得具有最高ORAC活性的F1-c组分（3.23μmol TE/mg peptides）。通过UPLC-ESI-MS/MS法分析,首次鉴定得到五条鸡软骨多肽:GGAP、QIGPA、QLGPA、MPKYA和QGPAN。采用MTT法和EdU法检测各多肽对MC3T3-E1细胞增殖的影响,结果表明0.1 mM的多肽QIGPA、QLGPA、MPKYA和QGPAN孵育细胞48 h后,细胞存活率分别提高39.34%、21.44%、21.23%和37.06%。其中,QIGPA多肽能够显著促进细胞DNA的合成（p<0.05）,EdU阳性细胞的占比高达16.89%。MC3T3-E1细胞的分化程度随着培养时间的延长而提高,鸡软骨多肽（0.1 mM）与分化培养基共同作用3d对该细胞碱性磷酸酶活性无显著影响（p<0.05）。相反,多肽作用7d均能显著提高细胞的碱性磷酸酶水平,且当分化时间延长至14d时,多肽QIGPA、MPKYA和QGPAN共同处理下细胞中NBT-甲瓒的平均光密度值均显著高于分化对照组（p<0.05）,且均高于0.61。其中,多肽QIGPA与QGPAN的碱性磷酸酶活性分别高达为200.03和276.56 nmol/min/mg protein。结果表明,鸡软骨多肽QIGPA、MPKYA和QGPAN具有促进MC3T3-E1细胞分化的能力。采用3.2μM的Cd（Ac）2孵育MC3T3-E1细胞48 h构建镉诱导的成骨细胞凋亡模型,并评价鸡软骨多肽（0.5 mM）的保护作用。CCK-8结果表明,多肽GGAP、QIGPA、QLGPA和QGPAN作用后细胞活率较模型组分别提高21.03%、38.54%、42.71%和13.69%。Annexin V-FITC/PI法实验结果显示这四条多肽处理后早期凋亡细胞占比分别为13.96%、25.48%、13.04%和8.20%,而对应的晚期凋亡和坏死细胞分别占14.01%、8.40%、3.16%和12.04%,能够显著逆转成骨细胞凋亡损伤（p<0.05）。其中,多肽QIGPA和QGPAN作用后其JC-1红绿平均荧光强度的比值较模型组分别增加15.71%和25.95%,揭示其能够显著逆转成骨细胞凋亡损伤模型的线粒体膜电位的下降（p<0.05）。除MPKYA多肽,其余四条鸡软骨多肽均能够通过抑制镉诱导的p-38与ERK1/2蛋白的磷酸化,从而降低成骨细胞的凋亡损伤。综上所述,从鸡软骨鉴定所得的QIGPA、MPKYA和QGPAN多肽能促进成骨细胞的增殖和分化;而多肽GGAP、QIGPA、QLGPA和QGPAN能够逆转成骨细胞凋亡损伤。上述结果揭示鸡软骨多肽能通过促进成骨细胞增殖分化和减缓成骨细胞凋亡损伤来而被选作潜在的骨健康保护活性成分。同时,这些多肽可作为骨健康相关功能性食品及特殊医学用途配方食品开发的原料,在保护骨健康方面具有广阔的应用前景。