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背景：松弛素是有多种功能的肽类激素，与胰岛素同属于胰岛素肽类家族，二者的结构有许多相似之处，但松弛素与胰岛素的受体和信号转导途径不同，前者是G蛋白偶联受体的配体，后者则是酪氨酸激酶的配体，它们化学结构类似，但是生物学特性迥异。研究发现，松弛素能松弛盆腔韧带、扩张子宫颈、抑制子宫收缩等，对非生殖系统的作用包括促进细胞分化和增殖、防止胶原沉积、抑制细胞凋亡、抗纤维化、舒张血管以及促进组织愈合，对维持组织器官稳态起重要作用，极具潜在的临床应用价值。但是目前尚无专一灵敏的测定松弛素活性的方法，亟待开发一种迅速、可靠、灵敏的方法测定松弛素的活性。目的：建立专属、灵敏的应用液相色谱串联质谱联用法（LC-MS/MS），测定猪松弛素（porcine relaxin，pRLX）活性的方法。该方法通过刺激THP-1细胞产生的cAMP，从而间接定量pRLX的生物活性。对比本实验建立的LC-MS/MS法，市售两种cAMP的ELISA试剂盒测定结果，验证LC-MS/MS法的可行性，为将来pRLX药物的开发提供理论依据。方法：首先，建立一种快速、可靠和可重复测定cAMP的LC-MS/MS方法。根据查阅的参考文献，选取8-Br-cAMP作为内标，使用高氯酸裂解并沉淀细胞蛋白。采用一系列不同浓度的pRLX刺激人单核白血病细胞THP-1，用建立的LC-MS/MS法测定pRLX刺激细胞产生的cAMP，以pRLX溶液的浓度作为横坐标，相应溶液刺激细胞产生的cAMP浓度作为纵坐标，建立pRLX的剂量效应曲线，计算pRLX的半最大效应浓度EC50值（concentration for50%of maximal effect）。其次，使用市售的两种cAMP试剂盒分别测定pRLX刺激细胞产生的cAMP，对比两种试剂盒和本实验建立的LC-MS/MS法的精密度和重复性，进一步证实实验建立的LC-MS/MS法的可行性和优势。最后，使用建立的LC-MS/MS法测定pRLX的生物学活性。结果：建立了灵敏、专属的LC-MS/MS法，测定pRLX刺激THP-1细胞产生的cAMP，应用于pRLX活性的测定。在一定的浓度范围内，pRLX溶液浓度与细胞产生的cAMP量成剂量效应关系。LC-MS/MS采用阳离子MRM检测胞内产生的cAMP，以8-Br-cAMP（150ng·mL-1）作为内标，使用高氯酸裂解并沉淀细胞蛋白。cAMP标准曲线的测定范围为5.0~992.0ng·mL-1（r≥0.992），方法学的最低检测限和最低定量限分别是0.5ng·mL-1和5.0ng·mL-1，日间准确度和精密度分别是94.9~102.2%RSD（relative standard deviation，相对标准偏差）和1.7~7.2%RSD，日内准确度和精密度分别是95.4~106.7%RSD和3.8~9.9%RSD。以猪松弛素样品检测，根据其剂量效应曲线，计算出它的EC50值为40.9ng·mL-1。本实验购买的两种测定cAMP的ELISA试剂盒（国产，Neweast），Neweast试剂盒的cAMP标准曲线的测定范围分别为0.2~137.1ng/mL（0.4-250.0pmol/mL，r≥0.971），国产试剂盒的cAMP标准曲线的测定范围0.5~6nmol/mL（r=0.995）。国产试剂盒的cAMP测定最低定量限不符合本实验要求，故不采用其测定pRLX刺激细胞产生的cAMP。以同样的猪松弛素样品检测，使用Neweast的试剂盒测定细胞产生的cAMP，根据其剂量效应曲线，计算出它的EC50值为54.4ng·mL-1。本方法结合LC-MS/MS法和细胞活性测定，测定了猪松弛素的生物活性。结论：实验建立的LC-MS/MS法能间接定量pRLX的生物学活性，相比市售的cAMP试剂盒，LC-MS/MS法的精密度和可重复性更好。结果表明，本研究建立的LC-MS/MS法为pRLX的活性测定提供了一种新方法。