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疫苗是预防流感的主要有效手段,在我国使用的流感疫苗仅有灭活的裂解疫苗或亚单位疫苗。流感减毒活疫苗滴鼻接种,使用方便,既可激发体液免疫,又可诱导产生局部黏膜免疫和细胞免疫,免疫保护效果优于灭活疫苗。但目前只有美国和俄罗斯生产流感减毒活疫苗,他们所使用的冷适应株骨架病毒分别为A/Ann Arbor/6/60(H2N2), B/Ann Arbor/1/66和A/Leningrad/134/17/57(H2N2), B/USSR/60/69,2003年第一支流感减毒活疫苗Flumist(?)在美国生产上市,上市之初疫苗适用人群年龄为5-49岁,2008年批准用于2岁及以上儿童。但都是用鸡胚作为培养基质生产的,以鸡胚作为基质生产流感减毒活疫苗,存在外源因子污染和将鸡传染病原因疫苗接种播散到人的潜在风险。此外,鸡蛋供应周期长,当大流感来袭时难以满足大规模生产,尤其是禽流感病毒来袭时鸡胚来源更受影响。鉴于此,WHO建议以哺乳动物细胞代替鸡胚作为流感疫苗生产基质,非洲绿猴肾细胞Vero细胞是WHO批准生产人用疫苗的传代细胞系。流感病毒在Vero细胞培养敏感性差,大多数毒株都不能增殖或者不能稳定传代。目前以Vero细胞作为培养基质生产的流感病毒疫苗只有3种,都是由美国Baxter公司研发生产(BSL-3)。一种是针对H5N1流感大流行前的疫苗Vepacel(?),在欧盟成员国销售；另一种是抗A(H1N1)pdm09的灭活流感疫苗Celyapan(?),已在欧洲批准上市；第三种是三价季节性流感裂解灭活疫苗Preflucel(?),其Ⅲ期临床试验已在18-49岁健康人群中完成。现尚无以Vero细胞为基质生产的流感减毒活疫苗,选育流感病毒Vero细胞冷适应株对于流感减毒活疫苗的研发至关重要,目前世界各国选育出的流感病毒Vero细胞冷适应株极为稀少,仅见一株A/Singapore/1/57ca(H2N2)报道。我们实验室在流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va(H3N2)的基础上经梯度降温选育出Vero细胞冷适应株,已在25℃连续传代50代。本实验中,对选出的A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)P50毒株在Vero细胞上25℃连续传代22代,TCIDso/mL保持10-7-10-7.5,25℃,33℃和39℃的log10TCID50/mL分别为7.5、7.7和3.7,具有冷适应表型(ca)和温度敏感表型(ts)；用107TCID50的病毒量滴鼻免疫雪貂,免后3天雪貂鼻甲和肺部的log10TCID50/g分别为2.6±0.3和1.4±0.1,表明此Vero细胞冷适应株具有减毒表型(att)；滴鼻免疫小鼠能产生体内细胞和体液免疫保护。经血清学鉴定,与H3N2抗血清血抑滴度达1：1280,而与H1N1、Bv和By抗血清无交叉,提示无其它亚型流感病毒交叉污染,比对第50代和第72代Vero细胞冷适应株基因序列,PBl片段G68T和NS片段C104G,均为无义突变,而其它片段未发现基因突变。搞清流感病毒Vero细胞冷适应株的冷适应相关基因,对加快流感病毒Vero细胞冷适应株的选育和流感减毒活疫苗的研发具有重要意义。目前研究报道的冷适应相关基因主要集中在PB2、PB1和PA片段,M、NP和NS片段亦有报道。本实验中,对A/Yunnan/1/2005Vca (H3N2)冷适应前后病毒株的基因和氨基酸序列进行比对,进一步模拟其3D结构并分析,结果提示PB1基因编码的PB1和PB1-F2蛋白冷适应前后变化较大,推测PB1可能是冷适应相关基因之一。进而利用反向遗传学技术,将冷适应株与Vero细胞适应株的PB1片段质粒互换,分别拯救流感病毒Vca/VaPB1和Va/VcaPB1。拯救株在Vero细胞上连续传代4代,Vca/VaPBl在33℃和25℃的log10TCID50/mL分别为7.1和3.8,表明此拯救株不具有ca表型,而Va/VcaPB1在33℃和25℃的log10TCID50/mL分别为7.4和6.5,证实PB1基因与流感病毒Vero细胞冷适应相关。科学家预测本世纪人类有面临流感大流行的风险,A/Yunnan/1/2005Vca (H3N2)作为Vero细胞大流行流感减毒活疫苗的母本株,可与高致病性禽流感病毒重配制备Vero细胞大流行流感减毒活疫苗毒种。但在评价疫苗免疫保护效果时,若直接使用病毒作为抗原,存在生物安全风险,需在BSL-3级实验室完成。流感假病毒,只能复制一代、不具感染性,如能采用流感假病毒来检测则可降低生物安全级别。本试验中,构建H5N1和H1N1亚型流感假病毒,以之作为病毒抗原,同时采用血抑试验、中和试验和ELISA检测抗原的微量中和试验,检测NIBSC标准血清、McAb、羊抗血清以及人群样本血清中相应亚型流感病毒的抗体滴度,并与完整病毒相比较。结果表明,假病毒与完整病毒检测的抗体滴度差异无统计学意义,同时采自2013年的人群血清抗体检测结果提示,人群中H5N1抗体阳性率为2.1%,抗体滴度17.82(8.72,36.43),而H1N1抗体阳性率达53.5%,抗体滴度25.78(22.09,30.08)。假病毒可用于流感中和抗体的评价。