鸭坦布苏病毒病是由坦布苏病毒（Tembusu virus,TMUV）感染鸭群引起的一种传染性疾病,其主要特征表现为产蛋鸭卵巢出血,产蛋率下降。目前,国内已经有全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗在临床上进行应用,在不同的鸭群中疫苗的免疫效果存在较大的差异。为补充目前TMUV疫苗的研究结果,本研究分析了TMUV主要毒力基因E基因Domain Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ序列和非结构蛋白NS1基因序列,原核表达了E基因优化序列（以下简称E基因）和NS1基因序列,然后对表达的蛋白进行分离,纯化和鉴定;用得到的目的蛋白制备疫苗,进行动物免疫保护试验。研究内容主要分为以下3个方面:的蛋白制备1、鸭坦布苏病毒E蛋白和NS1蛋白基因原核表达质粒的构建质粒的构建本研究根据实验室分离并保存的鸭坦布苏病毒,经测序得到鸭坦布苏病毒基因序列信息,从其中筛选出E蛋白基因的Domain Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ序列和NS1蛋白基因序列,并设计了E蛋白和NS1蛋白基因引物,通过合成引物并对目的基因片段进行扩增,成功得到了DTMUV的E基因片段和NS1基因片段,然后将得到的E基因片段用XhoⅠ和BamH Ⅰ限制性内切酶进行酶切,将得到的NS1基因片段用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行酶切,再将酶切好的目的基因片段进行电泳,电泳结束对含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块进行回收,以获取目的基因片段;将获取的目的基因片段分别与以同样酶切回收的载体pET28-a（+）进行连接,随后将连接产物用热激方法转化至表达菌BL21中,转化后的菌液均匀涂到固体LB平板上,过夜培养后挑取生长良好的单个菌落进行液体扩大培养。将培养后的菌液进行PCR扩增。提取PCR扩增阳性菌液质粒,用内切酶进行酶切鉴定,PCR扩增产物进行测序鉴定。结果显示,酶切构建的两个质粒后可分别得到大小约为1353 bp和4700 bp、1056 bp和4700 bp的片段,与预期结果一致,PCR测序结果正确,证明表达质粒pET-28a-DTMUV-E和pET-28a-DTMUV-NS1已构建成功。2、鸭坦布苏病毒E蛋白和NS1蛋白的原核表达及纯化将原核表达重组质粒pET-28a-DTMUV-E和pET-28a-DTMUV-NS1转化E.coli.BL21,使用IPTG进行诱导表达,确定IPTG最佳诱导浓度及诱导时间。试验结果表明,在37℃条件下,用1 mmol/L浓度的IPTG诱导6 h后,两种蛋白以包涵体蛋白成功表达,用SDS-PAGE电泳可分别得到大小约为49 KDa和39 KDa的蛋白条带,条带大小与预期的一致。将包涵体蛋白经镍柱亲和层析法进行分离和纯化,采用BCA蛋白定量法测得E蛋白和NS1蛋白的浓度分别为1.5 mg/mL和1.7 mg/mL;蛋白的纯化结束后,进行Western Blotting试验,曝光可见两条清晰特异性目的条带。3、鸭坦布苏病毒E蛋白和NS1蛋白亚单位疫苗的制备及免疫效果研究将纯化的重组E蛋白和NS1蛋白分别稀释至1 mg/mL,然后将E蛋白、NS1蛋白、E蛋白和NS1蛋白（1:1混合）分别与疫苗佐剂ISA71 VG油包水型（W/O）按照3:7的比例混合,搅拌乳化制备疫苗,检测其安全性和稳定性。将检测合格的疫苗免疫雏鸭,试验鸭分为6组,分别为E蛋白免疫组（Ⅰ组）,NS1蛋白免疫组（Ⅱ组）,E+NS1蛋白免疫组（1:1混合）（Ⅲ组）,鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫组（Ⅳ组）,鸭坦布苏病毒攻毒组（Ⅴ组）,正常对照组（Ⅵ组）。分别于14日龄、28日龄对4个免疫组肌肉注射重组蛋白乳化疫苗和灭活疫苗,从第1次免疫开始,每隔7天对各试验组鸭静脉采血,用ELISA方法检测疫苗免疫后血清中抗体滴度。当鸭龄42日时,每组随机抽取10只雏鸭进行攻毒试验,观察攻毒后鸭群精神状态、采集脾脏测定其肝脾指数变化,制备病理切片,对剩余10只雏鸭继续采血检测抗体效价。试验结果显示,E蛋白免疫组、NS1蛋白免疫组、E+NS1蛋白免疫组以及灭活疫苗免疫组均可以诱导雏鸭产生较高的抗体,其中抗体水平最高的是E+NS1蛋白免疫组免疫组,随后依次为E蛋白免疫组、NS1蛋白免疫组和灭活疫苗免疫组。在对雏鸭进行DTMUV攻毒试验后,经过免疫接种的雏鸭均存活良好,无明显的临床症状表现,而未经免疫注射的雏鸭,在攻毒后陆续出现精神沉郁、死亡情况;经过免疫注射的雏鸭肝脾指数与对照组无明显变化,肝脾形态也比较正常,无明显的病理变化;而未经免疫注射的攻毒组雏鸭,在攻毒后其肝脏和脾脏均出现不同程度的肿大与出血现象,脾脏切片显示有明显的病变特征。综上所述,本试验所制备的E蛋白和NS1蛋白疫苗均可以诱导雏鸭体内产生较高的DTMUV抗体水平,具有良好的保护效果,其中E蛋白和NS1蛋白混合免疫策略可以引起雏鸭体内产生更高的抗体水平,为后续研究DTMUV疫苗提供了更多的思路与选择。