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【目的】分析自身免疫性肝病(ALD)患者的临床特征,探讨CCN1在ALD患者中的诊断价值,为ALD患者的早期诊断提供帮助;探讨CCN1通过调控IL-6参与自身免疫性肝炎(AIH)发病的机制,为阐明AIH的发病机制提供理论依据和实验基础。【方法】1.分析ALD患者的临床特征,探讨CCN1在ALD患者中的诊断价值收集2009年7月至2019年7月之间在福建医科大学附属第一医院诊断为ALD的患者信息,根据中华医学会肝病学分会、中华医学会消化病学分会及中华医学会感染病学分会共同制定的最新诊断标准进行重新诊断,最终确诊107例ALD患者,根据不同疾病类型进行分类,其中AIH 59例,原发性胆汁性胆管炎(PBC)26例,自身免疫性肝炎合并原发性胆汁性胆管炎的重叠综合征(AIH-PBC OS)22例。收集其年龄、性别等一般资料,血常规、生化及免疫学等实验室检查结果,其中自身抗体中的抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)及抗平滑肌抗体(SMA)采用间接免疫荧光的方法检测,同时选取118例年龄性别相匹配的健康人的相应临床数据作为对照。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法检测ALD患者血清中的CCN1水平,选取同期年龄性别相匹配的健康人的血清作为对照,采用ROC曲线分析CCN1在ALD中的诊断价值。使用SPSS22.0软件进行统计分析,正态分布计量数据使用“均数±标准差”表示,四组样本均数比较使用Oneway ANOVA检验,两组间均数比较采用t检验;非正态分布计量数据采用“中位数(四分位数间距)”表示,四组样本计量资料比较采用Kruskal-Wallis H检验,两组样本间比较采用Mann-Whitney U检验;两组间阳性率的比较采用X~2检验和Fisher确切概率法。P<0.05表示差异有统计学意义。2.探讨CCN1通过调控IL-6参与自身免疫性肝炎发病的机制将由上海交通大学医学院引进的特异性表达Cre重组酶的CCN1flox/flox纯合子小鼠进行繁殖和鉴定,然后对其子代小鼠的基因型进行鉴定,选取基因型为CCN1flox/floxCre+的小鼠,在4~6周时采用他莫昔芬(1 mg/只/天)连续5天腹腔注射,构建CCN1基因条件性敲除小鼠。选取6~8周C57BL/6J小鼠作为对照组(NC-CCN1)和CCN1基因敲除小鼠作为实验室组(KO-CCN1),单次尾静脉注射Con A(20 mg/kg)构建AIH小鼠模型。8 h后摘除眼球取血,颈椎脱臼法处死,取肝脏标本。血清-80℃冻存,肝脏生理盐水冲洗后,一部分用4%多聚甲醛固定,常规包埋、切片后行苏木精-伊红(HE)染色检查和CCN1免疫组化,另一部分-80℃冻存备用。采用酶比色法在西门子ADVIA 2400生化分析仪测定小鼠血清ALT和AST的浓度,应用RT-PCR、Western blot及免疫组化的方法检测CCN1在肝脏的表达情况,运用RT-PCR方法检测IL-6 m RNA在血液及肝脏的表达情况。采用CCN1 si RNA 794干扰人正常肝细胞株LO2,使用实时荧光定量PCR检测细胞CCN1和IL-6 m RNA表达,Western blot检测CCN1蛋白表达水平,化学发光法检测细胞培养上清液中IL-6水平。【结果】1.ALD患者的临床特征以及血清中的CCN1水平AIH、PBC、AIH-PBC OS及HC四组患者比较,年龄、性别差异无统计学意义(F=0.367,P=0.777;X~2=5.553,P=0.125)。AIH与PBC、AIH-PBC OS及HC三组患者比较,血红蛋白含量[127(18.5)g/L、119(25.75)g/L、119.5(20.5)g/L、134(13.75)g/L,X~2=51.67,P<0.001],γ-谷氨酰氨基转移酶[133(134.5)U/L、302(401)U/L、317.5(411.75)U/L、16(9)U/L,X~2=151.74,P<0.001],乳酸脱氢酶[231(65)U/L、191(69.5)U/L、200.5(41)U/L、185(37)U/L,X~2=34.446,P<0.001],天门冬氨酸氨基转移酶[194(298.5)U/L、86(74.75)U/L、92.5(119.75)U/L、20(5)U/L,X~2=161.311,P<0.001],低密度脂蛋白胆固醇[2.1(1.01)mmol/L、3.065(1.2675)mmol/L、2.815(1.8275)mmol/L、3.04(0.755)mmol/L,X~2=40.377,P<0.001],总胆固醇[4.22(0.95)mmol/L、5.21(3.065)mmol/L、5.385(2.235)mmol/L、4.61(0.74)mmol/L,X~2=35.306,P<0.001],碱性磷酸酶[128(70.5)U/L、224.5(238.75)U/L、160.5(169.75)U/L、67(21)U/L,X~2=127.992,P<0.001]等指标存在显著性差异。54例AIH患者中有33例ANA阳性,检出率为61.1%;13例AIH患者SMA阳性,检出率为24.1%;10例AIH患者自身抗体全阴性。19例PBC患者,其中15例患者AMA阳性,检出率为78.9%;14例PBC患者ANA阳性,检出率为73.7%;其中3例患者AMA和AMA-M2全为阴性。16例AIH-PBC OS患者,其中10例患者ANA阳性,检出率为62.5%;9例AMA阳性,6例AMA-M2阳性。AIH患者血清中的CCN1水平明显高于健康人,P值<0.05。ROC曲线分析显示ALD、AIH、PBC及OS曲线下面积分别为0.8131、0.8755、0.7657和0.9097。2.CCN1通过调控IL-6参与AIH的发病成功建立CCN1基因条件敲除小鼠,与对照组相比,KO-CCN1小鼠肝组织中CCN1的m RNA和蛋白表达均明显下降。利用Con A诱导AIH的小鼠模型,KO-CCN1小鼠和NC-CCN1小鼠肝脏损伤比较,KO-CCN1小鼠ALT和AST水平较低,肝脏病理损伤相对较低,IL-6水平较低,提示CCN1基因在AIH中可能发挥介导肝细胞损伤作用。CCN1 si RNA 794干扰LO2细胞效果最佳,转染后,相比于对照组,CCN1 m RNA与细胞中CCN1蛋白水平均明显下降,IL-6 m RNA及细胞培养上清液中IL-6的水平也均明显下降。【结论】1.ALD患者实验室检查结果各异;血清CCN1在AIH中升高,有望成为AIH新的实验室诊断指标。2.成功构建了CCN1基因条件敲除小鼠。3.在AIH中,CCN1可能作为促炎因子,通过促进IL-6的表达从而促进AIH的发病,为阐明AIH的发病机制提供理论依据和实验基础。